全 文 ：基金项目:浙江省公益技术项目(编号:2013C32103) ;浙江省中医药科技计划 A类资助项目(编号:2013ZA119) ;浙江省新苗人才计划项目(编
号:2013Ｒ433007)
通讯作者:王静 Tel:18367489449 E-mail:28428541@ qq． com
三叶青提取物诱导人肝内胆管癌 HCCC-9810 细胞凋亡的研究
王静1 彭昕2 (1．宁波市鄞州人民医院病理科 浙江宁波 315000;2．浙江医药高等专科学校)
摘 要 目的:探讨三叶青提取物(Extract from Tetrastigma hemsleyanum，ETH)诱导人肝癌 HCCC-9810 细胞凋亡的作用及相
关机理。方法:MTT 法测定不同浓度和时间 ETH 处理后 HCCC-9810 细胞的增殖抑制率;Hoechst33258 染色法检验 HCCC-
9810细胞凋亡特征，流式细胞术检验不同浓度 ETH处理 HCCC-9810 后细胞凋亡率的变化;Western-blot法检验 ETH处理 HC-
CC-9810 后 Pro-caspase3 和胞浆细胞色素 C的表达变化。结果:ETH对 HCCC-9810 细胞生长具有明显的剂量与时间依赖性抑
制作用，ETH作用 HCCC-9810 细胞 24 h、48 h和 72 h后的 IC50值分别为275． 3 mg·L
－1、183． 3 mg·L －1、75． 8 mg·L －1。随着
ETH浓度增大细胞核出现染色质固缩，染色加深固缩等凋亡特征，细胞凋亡率逐渐增高，200 mg·L －1 ETH，24 h 处理组凋亡
率为(33． 5 ± 8． 1)%，胞浆细胞色素 C表达逐渐增强和 Caspase-3 前体量的下降。结论:ETH诱导 HCCC-9810 细胞凋亡，其机
制可能与激活 Caspase及其介导的线粒体凋亡途径的激活有关。
关键词 三叶青提取物;HCCC-9810;凋亡
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2015)07-1081-05
Apoptosis of Human Intrahepatic Cholangiocarcinoma Cells (HCCC-9810)Induced by the Extract from
Tetrastigma Hemsleyanum
Wang Jing1，Peng Xin2(1． Department of Pathology，Yinzhou People’s Hospital，Zhejiang Ningbo 315000，China;2． Zhejiang Pharma-
ceutical College)
ABSTＲACT Objective:To investigate the mechanisms for the apoptosis of human hepatoma HCCC-9810 cells induced by the ex-
tract from Tetrastigma hemsleyanum (ETH)． Methods:The cell proliferation inhibition of HCCC-9810 cells by ETH was observed by
MTT assay． Flow cytometric analysis was performed to confirm cell apoptosis ratio． The protein expression of CytC and Caspase-3 was
examined by Western-blot． Ｒesults:ETH could obviously inhibite the proliferation of HCCC-9810 cells in a dose-dependent and time-
dependent manner． The IC50 of ETH treatment for 24h，48h and 72h was 275． 3 mg·L
1，183． 3 mg·L －1 and 75． 8 mg·L －1，respec-
tively． The apoptosis rate of 200 mg·L －1 ETH treatment for 24h was(33． 5 ± 8． 1)% ． ETH also could increase the activation and
protein expression level of Caspase-3 in a dose-dependent manner． Conclusion:The apoptosis of HCCC-9810 cells induced by ETH is
based on the activation of mitochondrial apoptotic pathway．
KEY WOＲDS Extract from Tetrastigma hemsleyanum;HCCC-9810 cells;Apoptosis
我国是世界上肝癌的高发区，近 20 年来我国肝
癌的病死率增加了41． 17%，为我国肿瘤死因的第 2
位［1］。其中肝内胆管细胞癌占原发性肝癌的 10%
～15%，是一种恶性程度高，治疗效果及预后均较差
的肝脏恶性肿瘤。目前对肝内胆管细胞癌的治疗多
采用放化疗及手术治疗，但真正对胆管癌敏感的化
疗药物很少，且有较严重的不良反应，因此中远期疗
效不理想，预后较差。随着细胞凋亡的概念被引入
肿瘤研究，大量研究表明肿瘤的发生可能与细胞增
殖与凋亡的速度平衡失调有关［2 ～ 4］，因此诱导肿瘤
细胞凋亡成为了治疗的新方向［3］。近年来越来越
多中药提取物被证明不仅能有效地诱导肿瘤细胞凋
亡，特异性地杀伤癌细胞，而且对正常组织和细胞不
良反应小。
三叶青又名金线吊葫芦，可用于治疗高热、肝
炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病，也是
抗肿瘤常用药物。是浙江、福建、江西等少数地区独
有而珍贵的中药品种。三叶青总黄酮可促进肺
癌［4］、结肠癌［5］等多种肿瘤细胞的凋亡，三叶青总
氨基酸［6］、多糖［7］对四氯化碳致小鼠肝损伤均有明
显的保护作用，丁钢强等［8］以细胞活性、细胞乳酸
脱氢酶活力的改变为指标，研究发现三叶青提取物
中乙酸乙酯部分对肝癌细胞 HepG2 具有显著的体
外细胞毒作用，而其各部分的提取物对正常原代大
鼠细胞毒性均较小。因此三叶青有很高的抗肝癌潜
在价值，但其对人肝内胆管癌 HCCC-9810 细胞的作
用尚未见报道，且其抗肝癌的相关机制及其信号转
导途径的报道较少。本实验以体外培养的人肝内胆
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管癌 HCCC-9810 细胞株为研究对象，采用噻唑蓝
(MTT )法检测 ETH 对 HCCC-9810 细胞增殖抑制
率，Hoechst33258 染色法检验 HCCC-9810 细胞凋亡
特征，流式细胞术检测 ETH 对细胞凋亡率的影响，
Western-blot法检验 Pro-caspase3 和胞浆细胞色素 C
的表达变化，初步探讨 ETH 的作用靶点，为临床应
用三叶青提取物治疗肝癌提供体外实验依据。
1 材料与方法
1． 1 仪器
BIO-ＲAD 680 酶标仪(美国 Bio-Ｒad) ，Odyssey
CLX 红外荧光扫描系统(美国 Licor) ，Olympus bx51
倒置荧光显微镜(日本 Olympus) ，FACSCalibur 型流
式细胞仪(美国 BD 公司)。
1． 2 试药
人肝内胆管癌细胞 HCCC-9810 细胞株(中国科
学院上海生命科学研究院细胞资源中心) ;三叶青
药材(宁波医药药材股份有限公司，批号:131011) ，
三叶青提取物为自制，制备方法参见文献［9］:将药
材粉末用乙酸乙酯浸提 3 次，合并后减压浓缩，取少
量提取物初步化学检验证实含有黄酮类物质，标本
保存于浙江医药高等专科学校生物制药研究所。的
Western及 IP 细胞裂解液(碧云天生物技术研究
所)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天
生物技术研究所)、细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒
(碧云天生物技术研究所)、Caspase-3 抗体、β-actin
抗体、Cytochrome C抗体(北京全式金生物技术有限
公司) ;DMEM 培养基(美国 Invitrogen 公司) ;灭活
小牛血清(杭州四季青生物技术公司) ;荧光标记羊
抗鼠、羊抗兔二抗(美国 Licor生物公司)。
1． 3 MTT法测定细胞增殖抑制率
取培养于 DMEM培养基(含 10%胎牛血清、青
霉素链霉素双抗注射液终浓度各 100 U·ml －1)对
数生长期的 HCCC-9810 细胞，以 2 × 105 个 /ml的细
胞密度接种于 96 孔细胞培养板，培养 24 h 待细胞
完全贴壁后加入 ETH 至其终浓度分别为 25，50，
100，200 mg·L －1。于 5% CO2，37℃条件下分别培
养 24 h、48 h和 72 h。取出后每孔加入 20 μl 5 g·
L －1 MTT，继续在 37℃培养箱中孵育 4 h，小心吸出
各孔上清液后加入 180 μl DMSO，摇床震荡 10 min，
570 nm波长下测定吸光度(A)值，各组设 5 个复孔，
按下式计算各剂量组 HCCC-9810 细胞增殖的抑制
率。肿瘤细胞增殖抑制率(%) = (1 －实验组平
均 A 值 /对照组平均 A 值) × 100% 。根据各处理
组的细胞增殖抑制率，以药物浓度对细胞增殖抑制
率的对数值做直线回归，采用 SPSS 17． 0统计软件计
算各处理时间下 ETH的 IC50值
［10］。
1． 4 Hoechst 染色法观察细胞凋亡
取洁净盖玻片在 70%乙醇中浸泡 10 min，无菌
超净台内吹干，再用细胞培养液洗涤 1 遍。将盖玻
片置于六孔板内，种入细胞培养至密度约为 60%
满。加入 ETH至其终浓度分别为 50，100，200 mg·
L －1，培养箱孵育 24 h，刺激细胞发生凋亡后，吸除培
养液，加入 Hoechst染色试剂盒中的固定液，固定 20
min，用 PBS 洗两遍，每次 3 min，每孔加入0． 5 ml
Hoechst 33258 染色液，染色 5 min，用 PBS 洗两遍，
每次 3 min，以紫外光 350 nm 波长激发，发射波长
460 nm左右，荧光显微镜下拍照观察细胞凋亡形态
学改变。
1． 5 流式细胞仪检测细胞凋亡
按“1． 2”的方法培养，加入 ETH 至其终浓度分
别为 25，50，100，200 mg·L －1，培养箱孵育 24 h，用
不含 EDTA的0． 25%胰蛋白酶消化细胞，取 6 万左
右重悬的细胞，1 000 × g离心 5 min，弃上清，按 An-
nexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作说明对细胞
染色后立即用流式细胞仪 488 nm 波长处进行凋亡
率分析，每个样品检测 10 000 个细胞，重复 3 次。
1． 6 Western 蛋白印迹法检验凋亡相关蛋白表达
按“1． 4”项下方法培养，加入 ETH 至其终浓度
分别为 100 mg·L －1，加药后 24 h、48 h和 72 h，6 孔
板每孔加入 150 μl Western 细胞裂解液 4℃裂解细
胞 30 min，12 000 × g离心 10 min收集上清液，95 ～
100℃变性 10 min 后，电泳及转膜方法参见文
献［12］，经 SDS-PAGE胶(5%浓缩胶，12%分离胶)电
泳分离总蛋白，湿法转 PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭
1． 5 h，加入 Caspase-3 抗体、Cytochrome C抗体及 ac-
tin抗体(稀释倍数分别为 500，1 000，2 000)4℃摇
床过夜，TBST洗膜 3 次，加入荧光标记二抗室温摇
床孵育1． 5 h，洗膜 3 次后，用 Licor Odyssey CLX 红
外荧光扫描系统观察结果，以 β-actin 蛋白作为内参
照。胞浆中细胞色素 C的提取方法参考文献［13］。
1． 7 统计学分析
采用 SPSS 17． 0 统计软件分析，各指标以 珋x ± s
表示，行 t 检验和方差分析，以 P ＜ 0． 05为差异有统
计学意义，IC50值的计算采用 Probit分析，经 Logit模
型转换。
2 结果
2． 1 ETH对 HCCC-9810 细胞增殖的影响
不同浓度(25，50，100，200 mg·L －1)的 ETH作
用 HCCC-9810 细胞 24 ～ 72 h 后，对其增殖的抑制
率结果见表1。与空白对照组比较，各浓度药物处
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表 1 不同浓度、不同时间三叶青提取物作用 HCCC-9810 细胞后的 A值及细胞增殖抑制率(n =5)
组别
浓度
(mg·L －1)
24h 48h 72h
A(570 nm) 抑制率(%) A(570 nm) 抑制率(%) A(570 nm) 抑制率(%)
对照组 0 0． 6356 ± 0． 0252 / 0． 7467 ± 0． 0440 / 0． 8865 ± 0． 0573 /
ETH组 25 0． 6168 ± 0． 0301 2． 96 0． 6533 ± 0． 0420 12． 5 0． 6631 ± 0． 0610 25． 2
50 0． 5790 ± 0． 0235 8． 90 0． 5996 ± 0． 0354 19． 7a 0． 5434 ± 0． 0433 38． 7b
100 0． 5104 ± 0． 0412 19． 7a 0． 4966 ± 0． 0241 33． 5b 0． 4308 ± 0． 0384 51． 4b
200 0． 3896 ± 0． 0389 38． 7b 0． 3472 ± 0． 0156 53． 5b 0． 1924 ± 0． 0249 78． 3b
注:与对照组比较，aP ＜ 0． 05，bP ＜ 0． 01。
理组 HCCC-9810 细胞的生长均不同程度受到抑制，
除低浓度短时间(25，50 mg·L －1 ETH，24 h;25 mg
·L －1 ETH，48 h)处理组外，各组均与对照组有显著
差异(P ＜ 0． 05或 P ＜ 0． 01) ，其中作用时间为 72 h
时，各浓度 ETH处理组细胞增殖的抑制率与对照组
差异极显著(P ＜ 0． 01) ，且随着药物浓度的增加，抑
制率亦明显增加，呈现出显著的剂量和时间依赖性。
根据 IC50公式，分别计算出 ETH作用 HCCC-9810 细
胞 24 h、48 h 和 72 h 后的 IC50值分别为275． 3，
183． 3，75． 8 mg·L －1。
2． 2 Hoechst33258 染色后 HCCC-9810 细胞形态变
化
Hoechst 33258 是一种可穿透细胞膜对 DNA 染
色的细胞核荧光染料，常用于细胞凋亡检测。它们
在富集 AT序列的小沟处与 DNA 结合而发出强烈
的蓝色荧光，细胞发生凋亡时，染色质往往发生不同
程度的固缩，因此正常细胞的细胞核呈正常的圆形，
并呈弥散状蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓
染。从图 1 中可以看出对照组细胞核大，细胞膜完
整，呈圆形或椭圆形，核内的染色分布呈均一的淡蓝
色，而经浓度分别为 50，100，200 mg·L －1的 ETH处
理 24 h后，可见肿瘤细胞生长不佳，细胞核体积减
小，细胞核由于染色质固缩，染色加深而呈亮蓝色荧
光，其染色质分布不均匀，部分细胞核呈颗粒团状分
布，随处理药物浓度增高，可见核固缩细胞逐渐增
多，并出现漂浮细胞增多、片状无细胞生长区、细胞
核裂解为碎块等凋亡特征。
2． 3 ETH对 HCCC-9810 细胞凋亡率的影响
由图 2 可知，Annexin V-FITC检测细胞凋亡时，
图中左下象限为不被 Annexin V-FITC 和碘化丙啶
染色的正常活细胞群;图中右下象限 Annexin V-
FITC染色单阳性而碘化丙啶染色呈阴性的凋亡早
期细胞群;右上象限为 Annexin V-FITC 和碘化丙啶
染色双阳性的晚期凋亡的细胞，左上象限为 PI 单阳
性的坏死或机械损伤细胞群。总凋亡率为凋亡早期
和晚期细胞之和，结果显示随着 ETH浓度增大细胞
凋亡率逐渐增高，对照、50，100，200 mg·L －1 ETH
A．对照组 B． 50 mg·L －1 ETH处理组
C． 100 mg·L －1处理组 D． 200 mg·L －1处理组
图 1 Hoechst33258 染色检测 HCCC-9810 细胞凋亡
处理组的平均总凋亡率分别为: (4． 3 ± 1． 2)%、
(11． 3 ± 3． 8)%、(21． 5 ± 5． 4)%、(33． 5 ± 8． 1)%，
与对照组之间差异均有统计学意义(P ＜ 0． 05) ，各
处理组之间两两比较，差异均有统计学意义(P ＜
0． 05)。
2． 4 Wester-blot检测细胞色素 C 释放及 Caspase-3
表达变化
由图 3 可知，100mg·L －1 ETH诱导 HCCC-9810
细胞凋亡过程中，伴随着胞浆细胞色素 C 表达逐渐
增强和 Caspase-3 原酶的下降，100 mg·L －1 ETH 处
理 24 h后胞浆细胞色素 C出现明显表达，随着时间
延长，表达量越高，同时 caspase-3 原酶(pro-caspase-
3)被逐渐降解。
3 讨论
细胞凋亡即程序性细胞死亡。Hickman［14］首次
提出诱导细胞凋亡是抗肿瘤药发挥作用的重要方
式，细胞凋亡的调控是重要的组织内稳态机制之一，
其失常可以导致癌变和抗药性等病理情况［14］。通
过调控凋亡通路关键因子的表达促进肿瘤细胞凋亡
已成为肿瘤治疗的研究热点之一，研究表明，细胞凋
亡是通过激活特定的蛋白酶-半胱氨酸天冬氨酸蛋
白酶(caspase)家族来介导的［15，16］。促凋亡因子作
用于线粒体导致其跨膜电位降低，使细胞色素 C、凋
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A．对照 B． 50 mg·L －1 ETH处理组 C． 100 mg·L －1处理组 D． 200 mg·L －1处理组
图 2 流式细胞仪检测 HCCC-9810 细胞凋亡
图 3 ETH对 HCCC-9810 细胞胞浆细胞色素 C
和 Caspase-3 前体表达量的影响
亡诱导因子(AIF)、Bcl-2 家族以及膜间隙中的
Caspase 前体蛋白等从线粒体释放到膜间隙中，释放
到细胞质中的细胞色素 C 形成的凋亡体可激活
Caspase，使细胞进入凋亡程序，Caspase-3 是级联反
应下游的细胞凋亡主要执行因子，它的活化是细胞
进入凋亡不可逆阶段的标志，可切割许多重要底物，
导致凋亡特征性的变化，如核膜崩解、磷脂酰丝氨酸
外翻、染色质凝集等［14，17］。
胆道恶性肿瘤是源于肝胆管上皮细胞的恶性肿
瘤，是我国人口死亡的十大恶性肿瘤之一。其临床
起病隐匿，缺乏特异性，早期诊断难，误诊率高，确诊
时大多已属晚期，根治性手术切除率较低，预后较
差。化疗目前是恶性肿瘤综合治疗的主要措施，但
真正对胆管癌敏感的化疗药物很少，且不良反应强，
中草药不良反应相对较小，可以弥补化疗药物的不
足。从传统中药中寻找新的肿瘤细胞凋亡诱导成份
已成为近年来的研究热点。三叶青在民间用于肿瘤
的治疗已有较长的历史，但作用机制尚未阐明。本
研究采用 MTT 法和流式细胞术验证了三叶青提取
物诱导人肝癌 HCCC-9810 细胞凋亡的作用，并通过
Caspase 3 活力变化以及其前体蛋白，胞浆细胞色素
C的表达变化水平，初步探讨了 ETH 的作用靶点，
结果表明三叶青提取物可以有效抑制 HCCC-9810
细胞增殖，并呈现出时间和剂量依赖性，并推测其机
制可能与激活 Caspase 及其介导的线粒体凋亡途径
的有关，为临床应用三叶青提取物治疗肝内胆管细
胞癌提供体外实验依据。但在哺乳动物中，外源性
死亡受体途径和内源性线粒体凋亡途径是导致
Caspase 激活的两个主要的信号通路，三叶青诱导肝
癌细胞凋亡的具体信号通路还有待于进一步的研
究。
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参 考 文 献
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(2015-02-04 收稿 2015-03-31 修回
櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊
)
(上接第 1075 页)
表 5 统计预测最优值
条件
A提取时间
(h)
B液料比
(g·ml －1)
C乙醇
浓度(%)
提取温度
(℃)
逻辑水平 0． 58 0． 394 － 0． 088
实际水平 2． 29 26． 97 64． 56 85
表 6 最佳工艺条件验证(mg·ml －1，n =5)
编号 提取率 平均值
1 45． 9371
2 45． 9008
3 45． 9764 45． 9433
4 45． 9532
5 45． 9488
3 讨论
在植物提取工艺设计中常采用正交设计法，该
法只能处理离散的水平值，且无法找出整个区域上
因素的最佳组合和响应值的最优值，局限性较多;而
响应面分析法可将各因素与试验结果的关系进行多
项式拟合，给出具体的函数关系，通过函数模型进行
整体分析并进行优化。
单因素试验中，85℃左右即达到提取液沸点，过
高的温度会造成溶剂严重挥发不利于工业生产，因
此在考察其他因素前确定了提取温度为 85℃。
采用紫外分光光度法测黄酮含量与响应面法结
合，操作简便，检测快速，符合企业生产需求;抗癌散
总黄酮最佳提取条件为提取温度 85℃、乙醇浓度
645． 6%、提取时间2． 29 h、料液比 1 ∶ 26． 97，提取率
可达45． 94 mg·ml －1，为复方抗癌散植物的规模化
利用，总黄酮的提取生产工艺提供了参考依据。
参 考 文 献
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(2014-12-30 收稿 2015-04-01 修回)
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中国药师 2015 年第 18 卷第 7 期 China Pharmacist 2015，Vol． 18 No． 7