全 文 ：　实
验
研
究
论
著
三叶青提取物对人结肠癌
细胞系 RKO 细胞凋亡的影响
　　汪　珍1 　冯　健2 　王晓华3 　茅文亭3 　丁钢强4
1.浙江中医药大学附属第二医院　310005　2.浙江中医药大学药学院　3.浙江大学医学院附属妇幼保
健医院　4.浙江省疾病预防控制中心
　　基金项目:浙江省卫生厅医药科技项目(No:2006C151)
Fund pro ject:Item of Medical Sci-tech with Zhejiang Provincial H ealth Bureau(No:2006C151)
摘要:[ 目的] 观察三叶青提取物对人结肠癌细胞系 RKO 细胞凋亡的作用 , 初步探讨其可能的机制。[ 方法] 采用体外细胞培养
技术 , 用 MT T 法观察三叶青提取物 RKO 细胞的影响;琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;RT-PCR检测 Bid , Bax , Bcl-2 和 Bcl-XL
的表达改变。[ 结果]三叶青提取物能显著地抑制人结肠癌细胞系 RKO 细胞的生长 , 并且具有浓度依赖性 ,且细胞有明显的凋
亡特征性改变 , 并能下调 Bcl-XL 、上调 Bid 来诱导凋亡。[ 结论] 三叶青提取物具有对人结肠癌细胞系 RKO 细胞抗增殖和诱导
凋亡的作用 , 且呈剂量依赖性。
关键词:三叶青提取物;RKO 细胞;凋亡
中图分类号:R285.5　文献标识码:A　文章编号:1009-5509(2008)03-0321-03
Influence of Clover Extract on Human Colon Cancer Cellular PKO Apoptosis Wang Zhen , Feng Jian , Wang Xiaohua , e t al S econd
Hospital A f f i liated to Zhej iang Chinese Medical University , Hangzhou(310005)
Abstract:[Objective] To observe clover extract s effect on human colon cancer PKO cellular apoptosis , primarily explore its possi-
ble mechanism.[ Method] Take cell culture in vit ro and MT T technology to observe clover ex tract s influence on PKO cell , test
apoptosis with agarose gel electrophoresis , test the changes of Bid , Bax , Bcl-2 and Bcl-XL with PT-PCR.[ Result] Clover ex tract
can markedly inhibit PKO grow th , with dependence of concentration and obvious apoptosis change , also can dow n-regula te Bcl-XL ,
up-regulate Bid to cause apoptosis.[Conclusion] Clover ext ract has anti-hyperplasia and induces apoptosis to human co lon cancer
cellular PKO , in dependence of concentration.
Key words:clover ex tract;PKO cell;apoptosis
　　以往研究发现三叶青活性成分对体外培养的人
结肠癌细胞系 RKO具有显著的细胞毒作用 ,并表现
为凋亡特征 。为使三叶青在结肠癌临床治疗方面提
供理论依据 ,而进一步做此研究 。
1　材料和方法
1.1　细胞系和药物　大肠癌细胞系 RKO 由上海细
胞研究所提供。三叶青提取物由丁刚强博士提供。
1.2　实验方法　取对数生长期 RKO细胞 ,用含 10%
灭活小牛血清的 RPIM1640培养基 ,于 37℃、5%CO 2
条件下培养。用含 10%小牛血清的新鲜 RPIM1640
培养基稀释和三叶青活性物母液(5mg/ml),使成所需
浓度(5～ 15μg/ml),作用细胞 48hrs。(1)体外细胞生
长抑制试验。RKO细胞悬液(2×105/ml)分别以三个
平行复孔接种于 96孔板 ,每孔 100μl。37℃培养 24hrs
使细胞贴壁 ,用含不同浓度三叶青活性物的新鲜培养
基配成终体积 200ul , 37℃孵育 68h 后 ,每孔加 50μl
M TT(2mg/ml),继续培养 4hrs ,平板离心 1000rpm ×
10min ,弃去上清 ,加 120μl DMSO 溶解 MTT 结晶 ,平
板振荡10min ,570nm下 Elisa读值(Wallac)。(2)DNA
梯带检测。收集经 5 、10 、15μg/ml三叶青提取物和加
等量的溶剂作用 48h的 RKO细胞 ,用含 50mM Tris-
HCL(PH7.5),20mM EDTA 和 1%NP-40裂解缓冲液
裂解 ,然后加 1%SDS 和 Rnase(5μg/ml)到上清中 ,
56℃孵育 2hrs ,再加蛋白酶 K(2.5μg/ml)37℃孵育
2hrs。用醋酸铵(3.3M)和酒精(95%)溶解沉淀 ,加入
上样缓冲液 。DNA梯带经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检
测 ,EB染色观察。(3)RT-PCR检测。RKO 细胞 2×
10
5/ml浓度以 3 个平行复孔接种于 24 孔板 ,每孔
100ul(含2×104 细胞),培养 24h使贴壁。不同浓度三
叶青活性物作用 48hrs后 ,依次进行下列试实验:①细
胞总 mRNA的提取(氯仿一步法);②紫外分光光度计
测定 mRNA的含量;③反转录:dNTP(each 10mmol/
L)2μl 、5 ×buffer 4μl 、DTT(100mmol/L)1μl、RNAsin
(40U/μL)1μl、Oligo dT(100μmol/L)1μl 、总 RNA2μg 加
水至18μl后 65℃水浴5min ,并快速插入到冰水中 ,加入
RNAsin(40U/μl)1μl和 M-MLV反转录酶(200U/μl)1μl
后再37℃水浴 60min ,94℃水浴 5min(灭活返转录酶),
-20℃保存;④PCR扩增:dNTP(each 0.5mmol/ l)2μl 、
10×buffer4μl 、Mgcl2(25mmol/ l)4μl、上游引物(4μmol/ l)
1μl (Bax , ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGT ;Bcl-xl ,
GGAGCTGGTGGTTGACTTTCT ;Bcl-2 , ACTTGTG-
GCCCAGATAGGCACCCAG ;Bid ,GAC CCG GTG CCT
CAG GA;β-actin , AGGCCAACCGCGAGAAGAT-
GACC)、下游引物(4μmol/ l)1μl(Bax , ACAAACATG-
321
　浙江中医药大学学报 2008年 5月第 32卷第 3期
DOI :10.16466/j.issn1005-5509.2008.03.071
　汪　珍 ,等:　三叶青提取物对人结肠癌细胞系 RKO细胞凋亡的影响
GTCACG GTCTGC;Bcl-xl , CCGGAAGAGTTCAT-
TCACTAC ;Bcl-2 ,CAGC TTC GCCGAGATGTCCAGC-
CAG ; Bid , ATGGTCACGGTCTGCCA; β-actin ,
GAAGTCCAGGGCGACG TAGCAC)、反转录产物 4μl
和 Taq-DNA聚合酶(U/μl)0.4μl并加水至 40μl ,用石蜡
油 25μl 封盖;扩增条件为:95℃, 3min;94℃40s , 59℃
1min ,72℃2min ,共 30 个循环;72℃, 5min;最后 4℃保
存 ,并电泳后比较。⑤图像处理:取电泳凝胶底片 ,用
KS400型图像分析系统进行光密度扫描 ,以目的基因光
密度值与对应内参基因光密度值的比值作为该样品中
目的基因的相对转录量。最后以目的基因的相对转录
量为参数进行半定量统计分析。
1.3　统计学方法　计量资料数据统计用均数±标
准差(x ±s);多组间均数之间比较用方差分析(F 检
验),均采用 spss统计软件包统计分析。
2　结果
2.1　抑制 RKO 细胞增殖　三叶青提取物体外抑制
RKO 细胞增殖 ,其细胞毒性与药物浓度和作用时间
呈正比 。如图 1A 所示 , 5μg/ml及其以上浓度作用
68hrs引起 RKO 细胞增殖抑制 , 10μg/ml时细胞数
量明显减少 ,导致半数细胞死亡的药物浓度(IC50)
大约是 12.47μg/ml。图 1B 所示一定药物浓度时 ,
药物的抑制作用与作用时间呈正比。
2.2　DNA 梯带出现　根据三叶青提取物对 RKO
细胞毒性的 IC50 ,我们以 5 、10 、15ug/ml作为检测浓
图 1　细胞毒性与药物浓度和作用时间呈正比
度。如图 2 所示 ,药物处理组细胞基因组 DNA 断
裂 ,经琼脂糖凝胶电泳出现 180bp-200bp 倍数的梯
带。这些现象提示 ,三叶青提取物诱导体外培养的
RKO细胞发生凋亡。
2.3　RT-PCR检测 Bid , Bax , Bcl-2 和 Bcl-XL 的表
达　用 RT-PCR方法检测不同浓度三叶青提取物对
Bcl-2家族的表达影响 ,结果发现 Bcl-XL 的表达有显
著性的下降 ,Bid的表达有显著的上调 , Bax 和 Bcl-2
没有明显变化(见图 3)。
图 2　药物处理组细胞基因组 DNA 断裂　　　　　　图 3　RT-PCR检测 Bid , Bax , Bcl-2 和 Bcl-XL的表达
3　讨论
三叶青的化学成分目前尚未十分明了 ,丁钢强
等[ 1-2] 对三叶青的乙酸乙酯 、正丁醇和水 3 种提取法
进行了比较 ,结果显示以乙酸乙酯提取法效果最好 ,
主要是有 4个化合物 ,分别为 β-谷甾醇 、山奈酚 、槲
皮素和山奈酚-3-O-新橙皮糖苷 。其中槲皮素是植物
界分布最广 ,具有多种生物活性的黄酮类化合物 ,广
泛存在于蔬菜和水果中 ,同时它也是多种中草药的
成分 ,具有降血压 、降血脂 、抗炎 、抗过敏 、抗病毒等
多种生物学活性 ,对人类肿瘤 、衰老 、感染 、心血管疾
病的治疗和预防具有重要意义;而且最近的研究表
明[ 4] ,槲皮素一方面可以诱导多种肿瘤细胞凋亡 ,另
一方面又可以阻止一些非肿瘤细胞凋亡的发生。
恶性肿瘤细胞的主要特征之一为其失控的自主
性增殖 ,是细胞增生和死亡调控异常导致其平衡失
调的综合性结果。细胞凋亡的调控是级联式基因表
达的结果 。目前认为 ,细胞内部的基因直接调控凋
亡的发生和发展 ,细胞外部因素通过信号转导通路
影响这些基因的表达 ,从而间接调控凋亡 。Bax 是
bcl-2家族的一个主要成员 ,它们过度(下转第324页)
322
浙江中医药大学学报 2008年 5月第 32卷第 3期　
　李海涛 ,等:　运脾方对小鼠吞噬指数作用的研究
表 1　运脾方对小鼠免疫器官指数 、吞噬指数 K 和活性 a的影响(x±s)
组别 n 肝脏系数 脾脏系数 吞噬指数 K 吞噬活性 a
正常组 12 5.4822±0.7815 0.4662±0.1636 0.0182±0.0086　　　 4.4265±0.9479 　　
阳性对照组 12 5.4773±0.3854 0.4678±0.0735 0.0342±0.0125＊＊　 5.3994±0.8070 ＊　
运脾方大组 12 5.5443±0.3755 0.4987±0.1276 0.0349±0.0090＊＊＊ 5.3973±0.6257 ＊＊
运脾方中组 12 5.5376±0.2634 0.5509±0.1602 0.0310±0.0191＊　　 4.9845±1.0232 　　
运脾方小组 12 5.5833±0.6070 0.5837±0.2196 0.0224±0.0188　　　 4.2599±0.8100 　　
　　与正常组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 , ＊＊＊P<0.001
疫 、细胞免疫 、细胞因子 、分子免疫以及免疫遗传学
等方面异常改变均有极为显著的相关性[ 1] 。运脾治
疗对胸腺组织结构有较显著的恢复作用 ,可提高 Ig 、
SOD的含量 ,促进胸腺组织结构恢复等作用 ,从而显
著提高脾虚大鼠免疫功能[ 2] 。
单核巨噬细胞系统(网状内皮系统 , reticuloen-
do thelial sy stem , RES)是机体非特异性免疫系统的
重要组成部分。因能迅速清除多种致病物质 ,是维
持机体内环境稳定的一个最重要的系统。巨噬细胞
是免疫细胞的一种 ,具有多 种免疫功能如吞噬和杀
伤多种病原微生物 、处理和呈递抗原 、分泌细胞因子
(I L-1 、IL-6 、IL-8 、IL-12 、TNF-α)、表达共刺激分子以
加强 与 T 细胞的相互作用等方式参与免疫反应 ,在
炎症 、感染和肿瘤等许多疾病过程中发挥了重要的
作用。其吞噬机能是反映动物非特异性免疫功能的
主要指标之一 ,在一定范围内 ,体内碳颗粒被清除速
率与血碳浓度呈指数函数关系[ 3] 。巨噬细胞作为一
种重要的抗原呈递细胞 ,在脾脏中所占比例的变化 ,
可一定程度反映机体的免疫应答状况 。研究发现 ,
补气中药能使小鼠脾脏巨噬细胞的比例上调 ,提示
补气中药对巨噬细胞有一定的活性作用 ,而运脾方
主要成分中含有白术 、黄芪等补气健脾中药 ,经合理
配伍 ,对小鼠巨噬细胞的活性作用影响更为明显。
本文研究结果发现运脾方大 、中剂量能够增加小鼠
吞噬指数和吞噬活性 ,加快碳粒廓清的速度 ,提示运
脾方可能通过提高机体非特异性免疫的途径 ,增强
免疫力 ,提高机体对有害刺激的防御作用。
参考文献:
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(收稿日期　2007-12-25)
(上接第 322页)表达可诱发细胞凋亡;Bcl-xL 作用
在 Apaf-1的上游 ,它能通过其 BH4 区将胞浆中的
Apaf-1结合到线粒体外膜 , 从而阻断 Apaf-1 对
caspase-9的激活作用 ,从而导致细胞凋亡。近年研
究证明 ,肿瘤细胞确实存在细胞凋亡过程异常 ,在很
多肿瘤细胞有肿瘤抑制基因 p53 的缺失和突变 ,因
此凋亡过程的减弱显而易见。在肿瘤细胞还发现有
bcl-2基因过度表达 。细胞凋亡的特征性表现是
DNA梯带出现 ,这是 DNA 在核小体连接部位被剪
切的结果 ,与细胞内特定蛋白酶系统激活有关 。
本研究结果表明 ,三叶青提取物 5 ～ 15μg/ml浓
度作用 48hrs 后 , RKO 细胞基因组 DNA 电泳出现
剂量依赖性梯带增强 ,说明该药物引起 RKO 细胞凋
亡 。为探讨细胞凋亡的机制 ,我们检测了线粒体凋
亡通路上的主要凋亡相关基因及表达产物 Bcl-2家
族成员 。结果如图 3所示 ,Bcl-2家族成员中的抑凋
亡因子 Bcl-XL的信使 RNA 和蛋白表达均剂量依赖
性增加 ,而促凋亡因子 Bid在基因和蛋白水平都表现
为下调。Bcl-XL 是线粒体膜蛋白 ,表达下降会引起
膜通透性增加 ,导致细胞色素 C 释放。因此 ,三叶青
提取物引起的 RKO 细胞凋亡是通过下调 Bcl-XL 、上
调 Bid ,最终可能导致导致线粒体释放细胞色素 C ,
级联激活 Caspase 家族成员所致 。且三叶青提取物
(5-15μg/ml)诱导人结肠癌细胞系 RKO 细胞凋亡呈
剂量依赖性。
参考文献:
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(收稿日期　2007-12-22)
324
浙江中医药大学学报 2008年 5月第 32卷第 3期