全 文 ：[基金项目 ] 　浙江省中医药科研基金项目 2006C151,浙江省中医
药管理局 “中药保健食品功能学 ”重点学科内容之
一。
[作者简介 ] 　徐彩菊(1964-),女 ,主任医师 ,主要从事免疫 、抗
肿瘤及其机制研究。
【实验研究】
三叶青提取物对白血病 K562细胞增殖的抑制作用
徐彩菊 1 ,吴平谷 1 ,孟佳 1 ,姚亚萍1 ,傅剑云 1 ,鹿伟 1 ,白宁宁 2 ,丁钢强 1
(1.浙江省疾病预防控制中心 , 杭州　310051;2.湖南科技大学 ,湘潭　411201)
[摘要 ] 　目的:探讨三叶青提取物对白血病 K562细胞增殖的抑制作用及其作用机制。方法:将不同浓度的受试物作用
于体外培养的 K562细胞 , 用四氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞生长抑制率 , 应用流式细胞仪观察细胞凋亡 , 采用实时荧
光定量 PCR技术分析 P53和 C-myc基因的 mRNA表达水平。结果:受试物对白血病细胞的增殖具有明显的抑制作用 ,
能诱导白血病 K562细胞发生凋亡 , 对 P53基因的 mRNA表达水平有明显上调趋势 , 而对 C-myc基因的 mRNA表达水
平则有明显下调趋势。结论:三叶青提取物具有显著的体外抗白血病作用 , 促进抑癌基因 P53高表达和癌基因 C-myc
的低表达可能是其重要作用机制之一。
[关键词 ] 　三叶青提取物;白血病细胞 K562;细胞增殖;细胞凋;P53;C-myc
[中图分类号 ] 　R730.52　　　　[文献标识码 ] 　A　　　　[文章编号 ] 　1004-8685(2010)11-2801-03
InhibitoryeffectonproliferationofK562 cellinebyextractfromtetrastigmahemsleya-
numdielset.Gilg
XUCai-ju1 , WUPing-guo1 , MENGJia1 , YAOYa-ping1 , FUJian-yun1 , LUWei1 , BAINing-ning2 , DINGGang-
qiang1
(1.TheCenterforDiseasePreventionandControlofZhejiangProvince, Hangzhou310051, China;2.HunanUniversityofSci-
enceandTechnology, Xiangtan411201, China)
[ Abstract] 　Objective:ToinvestigatetheinhibitoryeffectofextractfromTetrastigmaHemsleyanumDielset.Gilg(TDG)on
humanleukemiaK562 cellsanditsmechanism.Methods:VariousconcentrationsofextractfromTDGweregiventoK562 cels
invitro.TheinhibitoryratioofthecelsweremeasuredbyMTTassay.Theapoptosiswasobservedbyflowcytometry(FCM).The
mRNAexpressionofP53andC-mycgennicwereanalyzedbyRealTimeFluorescenceQuantitative(RTFQPCR).Results:The
extractfromTDGcouldinhibitthegrowthofK562 cellsandinduceapoptosis, obviouslyincreasethemRNAexpressionofP53
anddecreasethemRNAexpressionofC-myc.Conclusion:TheextractfromTDGhasanti-leukemiaefectioninvitro.Itmay
beoneofthemostimportantmechanismsthattheextractfromTDGpromoteshighexpressionofP53 andlowexpressionofC-
myc.
[ Keywords] 　Extractfromtetrastigmahemsleyanumdielset.Gilg;eukemicK562 cells;celularproliferation;apoptosis;
P53;C-myc
　　三叶青作为中药在民间已有较长的服用历史。目前临床
上往往将三叶青与其他中草药配伍使用治疗恶性肿瘤病人 ,
具有较好的疗效 [ 1] 。我们前期的研究结果表明三叶青乙酸乙
酯提取物具有增强正常小鼠免疫力的作用 [ 2] , 而三叶青水提
取物则对 S180荷瘤小鼠具有抑瘤作用 [ 3] 。我们的预实验结
果表明 , 三叶青另一种提取物(酚类化合物)对白血病细胞非
常敏感 , 而目前三叶青提取物抗白血病作用及其相关的作用
机制至今未见报道。
本研究通过三叶青提取物对体外培养的白血病 K562细
胞的增殖抑制作用及其诱导细胞凋亡作用 , 观察其体外抗白
血病作用;从 P53和 C-myc基因的 mRNA表达水平的变化 ,
进一步探讨其作用机制 , 为三叶青临床应用提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　三叶青提取物　三叶青块根用 75%的酒精提取 , 低温
真空后得浓缩液 , 浓缩液经乙酸乙酯提取物再经柱层析分离 ,
冰冻干燥后得到的样本 , 即为本次实验的受试物 , 4℃冰箱保
存备用。
1.1.2　细胞系　K562细胞由浙江大学第一附属医院血液科
惠赠 , 张氏肝细胞由浙江大学第二附属医院消化科惠赠。
1.1.3　主要试剂　RPMI1640培养基 ,美国 GIBGO公司产品;
胎牛血清(Bs),美国 HYCLONE公司产品;大鼠抗人 P53单克
隆抗体 , 美国 SANTACRUZ生物技术公司产品;大鼠抗人 C-
2801中国卫生检验杂志 2010年 11月第 20卷第 11期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Nov2010;Vol20　No11
myc单克隆抗体和蛋白提取试剂 , 美国 PIERCE公司产品;四
甲基偶氮唑盐(MTT), 美国 Mluka公司产品;TRIzol试剂(In-
vitrogen公司产品),反转录试剂盒 TAKARA(大连宝生物工程
有限公司)等。
1.1.4　主要仪器　倒置显微镜(LeicaDMIL型 , 德国 Leica
351公司)、显微镜(CH30型 ,日本 Olympus公司)、流式细胞仪
(Facscalibur, 美国 BD公司)、酶标仪(MultiskanMK3, 上海雷
勃分析仪器有限公司)、实时荧光定量 PCR仪(ABI7000型 ,
美国 ABI公司)、CO2培养箱(2323 -2型 , 美国 SHELLAB公
司)、超净台(SW-CJ-2FD型 , 苏州净化设备有限公司)、高
压灭菌消毒器(TOMYSS-325, 日本 TOMY公司)等。
1.1.5　细胞培养　将 K562细胞接种于 RPMI1640培养液中
(含 10%胎牛血清 , 100U/ml青霉素 、链霉素), 37℃, 5% CO2
饱和湿度下常规培养 。每 2 ～ 3天换液传代。
1.2　方法
1.2.1　细胞增殖抑制实验　取处于对数生长期的 K562细胞进
行细胞增殖抑制实验。将 K562细胞浓度调整为 2×106个 /ml。
对照组:常规培养;受试物组:在 96孔板培养体系中加入不同浓
度的受试物 (终浓度分别为 0、 3.13 μg/ml、 6.25μg/ml、
12.50μg/ml、25.00 μg/ml、50.00 μg/ml、 100.00 μg/ml), 分别
在培养第 24 h、 48 h、 72 h取样 ,上酶标仪(波长 570nm)测定。
根据测定的吸光值观察不同药物浓度作用不同时间对细胞增殖
的影响。生长抑制率(%)=1-(实验孔 A值 -空白孔 A值)/
(对照孔 A值 -空白孔 A值)×100%。
1.2.2　细胞凋亡实验　给不同浓度受试物(终浓度分别为 0、
1.56 μg/ml、3.13 μg/ml、 6.25 μg/ml), 24h后 ,分别取一定数
量的 K562细胞洗涤 、离心后 , 按细胞凋亡测定试剂盒说明书
进行操作 , 然后进行流式细胞仪检测 , 用 CelQuest分析软件
对各样本进行细胞凋亡情况分析。
1.2.3　P53和 C-myc基因的 mRNA表达实验　给不同浓度
受试物 (终 浓 度分 别 为 0、 0.39 μg/ml、 0.78 μg/ml、
1.56 μg/ml、3.13 μg/ml、6.25 μg/ml), 24 h后 , 进行总 RNA
提取 , 设计 、合成引物 , 逆转录反应 ,用实时荧光定量 PCR仪进
行分析 、检测。以 β -actin基因作为内参基因。基因表达相
对量 =2(-■CT)×100, ■CT=CT目的基因 -CT内参基因。
2　结果
2.1　三叶青提取物对 K562体外白血病细胞增殖抑制作用的
影响
受试物在体外对 K562细胞有较明显的增殖抑制作用 ,其
抑制强度随受试物浓度增加而增强 , 增殖抑制率在 72 h达最
高 , 为 95%。而相同剂量的受试物对人正常肝细胞(张氏肝)
的增殖抑制率在 72h达最高 ,为 20%。因此 ,受试物在实验浓
度范围对正常人肝细胞未显示明显的细胞毒作用 , 见图 1、
图 2。
图 1　K562细胞增殖抑制情况
图 2　受试物对 K562细胞增殖的影响
2.2　三叶青提取物对 K562体外白血病细胞凋亡的影响
受试物各浓度组对 K562细胞的凋亡数增加。 并且随着
受试物浓度增加 , 凋亡百分率也相应增加 , 呈现剂量依赖性关
系 , 见图 3。
图 3　受试物对 K562细胞凋亡的影响
2.3　三叶青提取物对 K562体外白血病细胞 P53和 C-myc
基因 mRNA表达水平的影响
受试物各浓度组对 K562细胞的 P53基因的 mRNA表达
水平均有明显上调趋势;受试物终浓度为 3.13、6.25 μg/ml
时 , 对 K562细胞的 C-myc基因的 mRNA表达水平有明显下
调趋势 , 见图 4、图 5。
3　讨论
　　肿瘤的发生和发展不仅同肿瘤细胞的增殖和分化异常有
关 , 而且同细胞凋亡的相关调控基因的变化有关。 已证实细
胞凋亡减少可引起肿瘤的发生 , 且通过逃避凋亡而促进肿瘤
2802 中国卫生检验杂志 2010年 11月 第 20卷 第 11期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Nov2010;Vol20　No11
细胞的恶性转化及演变 , 因此诱导肿瘤细胞凋亡的治疗策略
已成为近年来肿瘤治疗领域的热点问题。
本次研究中细胞增殖抑制试验采用 MTT比色法。 MTT
法的基本原理是活细胞线粒体内脱氢酶可将 MTT还原为蓝紫
色的甲腊(formazan), 且细胞的存活数与其产生的甲腊的 A值
之间成正比关系 [ 4] 。本次实验结果显示 , 受试物能明显抑制
K562细胞的增殖 ,且对正常细胞无明显毒作用 , 因此进一步证
实了受试物可干扰 K562细胞代谢 , 导致其线粒体功能障碍。
诱导细胞凋亡是肿瘤治疗中十分重要的方式之一。细胞
凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式。 P53基因编
码 53KD的磷酸化蛋白质 ,有野生型和突变型两种存在形式。
P53是重要的细胞凋亡调节因子 ,也是传统上大家最认可的细
胞凋亡活化基因。 Yonish首例报道了细胞凋亡可能是突变的
P53基因诱导慢性白血病发生的真正原因 [ 5] 。 P53基因抑制
肿瘤生长主要通过其抑制 DNA复制或者促进细胞凋亡完成。
C-myc基因是一种多功能基因 ,定位于人第 8号染色体 , 编码
分子量为 62 KD的蛋白质。 C-myc蛋白位于细胞核内 , 具有
转录因子活性 , 一方面能激活控制细胞增殖的基因 , 另一方面
也能激活促进细胞凋亡的基因表达 , 故具有促进细胞增殖和
凋亡的双重作用。
本次研究显示 , 受试物能增加 K562细胞的凋亡细胞数 ,
并且随着受试物浓度增加 , 凋亡百分率也相应增加 , 呈现剂量
依赖性关系 , 说明受试物对上述肿瘤细胞的凋亡有促进作用 ,
其凋亡途径可能与线粒体受损有关;通过对抑癌基因 P53和
癌基因 C-myc的核酸水平的进一步分析发现 , 受试物能明显
上调 K562细胞内的 P53基因 mRNA表达相对量 ,同时也能明
显下调癌基因 C-myc的 mRNA表达相对量。
进一步对我们的研究结果进行分析发现 , 低剂量(终浓度
为 1.56 μg/ml)时 , K562细胞的凋亡百分率和 P53的 mRNA
表达相对量均略有增加 , C-myc的 mRNA表达相对量变化则
不明显;当受试物终浓度达 3.13 μg/ml时 , K562细胞的凋亡
百分率和 P53的 mRNA表达相对量均明显增加 , C-myc的
mRNA表达相对量明显下调;当受试物终浓度从 3.13 μg/ml
升高到 6.25 μg/ml时 , K562细胞的凋亡百分率 、P53和 C-
myc的 mRNA表达相对量明显改变均不明显 , 三者呈现高度
一致性 , 提示我们受试物的最佳有作用终浓度为 3.13 μg/ml,
且其有效作用浓度范围较窄。
综上所述 , 受试物能明显抑制 K562 细胞的增殖 , 诱导
K562细胞的凋亡 ,提示促进抑癌基因 P53 mRNA高表达和癌
基因 C-mycmRNA的低表达可能是其重要作用机制之一。
[参考文献 ]
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apoptosisofmyeloidleukemiacelsthatisinhibitedbyinterleukin-6
[ J] .Nature, 1991, 352:345-347.
(收稿日期:2010-06-23)
2803中国卫生检验杂志 2010年 11月第 20卷第 11期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Nov2010;Vol20　No11