全 文 ：三叶青提取物诱导肺癌 A549 株细胞凋亡的研究
曾娟 周婷 童雪晴 刘燕丽 李遥 王小莉
【摘要】 目的 探讨三叶青提取物对肺癌细胞 A549 的作用，初步探讨其机制。方法 采用体外细胞培养技术，采用流式
细胞仪检测 A549 细胞株的细胞周期分布相和细胞凋亡率。结果 流式细胞仪检测结果显示:加三叶青提取物 10 －1 g /L、10 －2
g /L处理后的细胞凋亡比例明显高于对照组。结论 三叶青提取物对 A549 细胞具有诱导凋亡的作用。
【关键词】 三叶青提取物;A549 株细胞;凋亡
Influence of Clover Extract on Human Colon Cancer Cellular A549 Apoptosis ZENG Juan，ZHOU Ting，TONG
Xue-qing，LIU Yan-li，LI yao，WANG Xiao-li Medical college of jishou university，Hunan，Jishou 416000
【Abstract】 Objective To observe clover extract’s effect on human colon cancer A549 cellular apoptosis，primarily explore its
possible mechanism．Method Take cell culture in vitro and technology to observe clover extract’s influence on A549 cell． Result Flow
cytometric testing results show that the three experiments with 10 －1 g /extract L，10 －2 g /L treatment of apoptosis was significantly higher
than the proportion in the control group． Conclusion Clover extract has anti － hyperplasia and induces apoptosis to human colon cancer-
cellular A549．
【Key words】 clover extract;A549 cell;apoptosis
基金项目:湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划［湘教通
(2010)224 号］吉首大学大学生研究性学习和创新性实验
计划项目［编号:(2010)-36］
作者单位:416000 湖南 吉首，湖南吉首大学医学院
通讯作者:王小莉，E-mai:lwangxiaolif@ 163． com
三叶青是我国独有的珍贵物种，集抗肿瘤、抗病毒、消炎、
清热、增强免疫、健脾胃、无毒等多种特性为一体，徐彩菊［1］
等对三叶青提取物抗肿瘤抑制进行了初探，本研究对三叶青
提取物作用于 A549 肺癌细胞，通过采用流式细胞仪检测
A549细胞株的细胞周期分布相和细胞凋亡率，初步探讨其诱
导凋亡的机制。
材料与方法
一、细胞系和药物:肺癌 A549 细胞及三叶青提取物购于
湖南艾杰公司。
二、实验步骤
1、消化收集生长状态良好的 90%满瓶 A549 细胞，调整
细胞密度至 1 × 105 cells /ml 种 6 孔细胞培养板 2 块，每孔 2
ml细胞悬液，置 37℃、5% CO2、饱和湿度细胞培养箱培养 24
小时，待细胞完全贴壁，生长状态良好时加药处理。
2、加药处理:生理盐水作为对照组，实验组为不同浓度的
三叶青提取物(浓度:10 －1 g /L;10 －2 g /L;10 －3 g /L) ，每组设 3
平行孔，37℃、5% CO2、饱和湿度细胞培养箱处理 72 小时后
收集细胞。
3、收集细胞:小心收集细胞培养液到一离心管内备用。
用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下
来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，
并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000 g 左右离心 3
～ 5 分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约 50 微升左
右的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1 毫升冰浴预冷的
PBS，重悬细胞，并转移到 1. 5 毫升离心管内。再次离心沉淀
细胞，小心吸除上清，可以残留约 50 微升左右的 PBS，以避免
吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成
团。
4、固定细胞:加入 1 毫升冰浴预冷 70%乙醇中，轻轻吹
打混匀，4℃固定 12 ～ 24 小时。1000 g 左右离心 3 ～ 5 分钟，
沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约 50 微升左右的 70%
乙醇，以避免吸走细胞。加入约 1 毫升冰浴预冷的 PBS，重悬
细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约 50 微
升左右的 PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当
分散细胞，避免细胞成团。
5、碘化丙啶染色液的配制(现配现用)。
6、染色:每管细胞样品中加入 0. 5 毫升碘化丙啶染色液，
缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴 30 分钟。随后可以
4℃或冰浴避光存放。染色完成当日完成流式检测。
7、流式检测和分析:用流式细胞仪在激发波长 488 nm波
长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。
三、统计学方法:计量资料数据统计用均数 ±标准差(珋x ±
s) ;多组间均数之间比较用方差分析(F检验) ，均采用 spss统
计软件包统计分析。
结 果
加三叶青 10 －1 g /L 处理后，细胞 S 期与对照组比较，明
显降低;分别加三叶青 10 －2 g /L、10 －3 g /L处理后的细胞与对
照组比较无明显的 S 比例变化。分别加三叶青 10 －1 g /L、
10 －2 g /L处理后的细胞凋亡坏死比例明显高于对照组，加三
叶青 10 －3 g /L处理后的细胞无明显变化(见表 1、2)。
表 1 加三叶青提取物处理后细胞 S期变化
分组 对照
10 －1
g /L(* )
10 －2
g /L
10 －3
g /L
S期(%) 25． 16 16． 23 19． 45 25． 95
26． 73 17． 77 23． 88 26． 09
27． 14 21． 05 34． 25 24． 41
* 与对照组比较 P ＜ 0. 05
讨 论
恶性肿瘤细胞的主要特征之一为其失控的自主性增殖，
286 临床肺科杂志 2012 年 4 月 第 17 卷第 4 期
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表 2 加三叶青提取物处理后细胞凋亡率变化
分组 对照
10 －1
g /L(* )
10 －2
g /L(* )
10 －3
g /L
凋亡率(%) 15． 63 34． 41 40． 76 25． 58
15． 38 35． 09 43． 71 47． 36
12． 10 41． 83 26． 68 53． 26
* 与对照组比较 P ＜ 0. 05
是细胞增生和死亡调控异常导致其平衡失调的综合性结果。
汪珍［3］等采用体外细胞培养技术用 MTT 法观察三叶青提取
物对 RKO细胞的影响，结果显示三叶青提取物能显著地抑制
人结肠癌细胞系 RKO 细胞的生长并且具有浓度依赖性。丁
钢强［3］等发现三叶青提取物对肝癌细胞 HepG2 具有明显的
体外细胞毒作用，其毒性作用与药物的浓度和作用时间呈明
显正相关。冯正权［4］等发现三叶青黄酮能显著地抑制胃癌
细胞 SGC 7901 的生长，并且具有浓度依赖性。本研究在肺癌
A549 细胞本研究通过流式细胞仪检测三叶青提取物的三种
不同浓度作用于 A549 细胞，观察 A549 细胞表现出不同程度
的凋亡。加三叶青提取物 10 －1 g /L处理后，肺癌 A549 细胞 S
期细胞的增殖能力明显降低，而分别加三叶青 10 －2 g /L、10 －3
g /L处理后的细胞无明显变化，可能 A549 细胞对三叶青无剂
量依赖还存在其他未知原因。加三叶青提取物 10 －1 g /L、
10 －2 g /L处理后的细胞凋亡比例明显增加，加三叶青 10 －3 g /
L处理后的细胞无明显变化，结果显示 3 种不同浓度提取物
中以 1 × 10 －1 g /L促进细胞凋亡效果最好。本研究结果提示
三叶青提取物能较好的抑制细胞生长，促进 A549 细胞凋亡。
可见，三叶青提取物在体外对 A549 人肺癌细胞的生长
有较好的诱导凋亡作用，在肺癌临床治疗方面有重要的指导
意义。
参考文献
［1］ 徐彩菊，白宁宁，孟佳，等． 三叶青提取物体内抑瘤作用及其
机理研究［J］．中国卫生检验杂志，2009，19(2) :278 －
［2］ 汪珍，冯健，王晓华，等． 三叶青提取物对人结肠癌细胞系 RKO
细胞凋亡的影响［J］．浙江中医药大学学报，2008，32(3) :321 －
322，324．
［3］ 丁钢强，郑军献，魏克民，等． 三叶青提取物对肝癌细胞 HepG2
及原代大鼠肝细胞的体外毒作用研究［J］． 浙江预防医学，
2005，17(9) :15．
［4］ 冯正权，倪克锋，何煜，等．三叶青黄酮诱导 SGC． 7901 胃癌细胞
凋亡的实验研究［J］．中国临床药理学与治疗学，2006，11(6) :
669 － 672．
［收稿日期:2011 － 09 － 06］
腋下微创小切口治疗 58 例胸部肿瘤的临床应用
罗国军 张利 凃东 石云 李卓东 彭京平 刘鑫
【摘要】 目的 探讨腋下微创小切口术治疗胸部肿瘤的手术方法以及应用价值。方法 利用腋下微创小切口术治疗 58
例胸部肿瘤患者，其中肺癌 32 例，肺部良性肿瘤 11 例，食管癌 9 例，纵隔肿瘤 6 例。结果 所有患者手术无死亡病例。平均手
术时间为 3. 5 h;清除淋巴结 6. 5 枚 /例;开胸时间平均 6. 8 min;关胸平均 17. 4 min;胸腔引流管平均放置时间 3. 75 d;术后平均
住院时间为 8. 32 d。术后疼痛分级:1 级 56 例，2 级 1 例，3 级 1 例。3 例患者出现术后并发症，经治疗后全部治愈。结论 腋下
微创小切口术治疗胸部肿瘤损伤小，术后恢复快，疼痛程度轻，可作为临床治疗胸部肿瘤的方法推广使用。
【关键词】 腋下小切口术;胸部肿瘤
Clinical Study of Minimally Invasive Incision Below Axilla in 58 Patients with Chest Tumor LUO Guo-jun，
ZHANG Li，TU Dong，SHI Yun，LI Zhuo-dong，PENG Jing-ping，LIU Xin Department of Thoracic Surgery of Kunming
General Hospital of Chengdu Military Command Yunnan Kunming 650032
【Abstract】 Objective To investigate technique and application value of minimally invasive incision below the axilla in chest
tumor patients．Methods Minimally invasive incisions below the axilla were performed for 58 patients with chest tumor including 32 lung
cancers，11 benign cancers，9 esophageal cancers and 6 mediastinal cancers． Results There were no fatalities during surgical procedures．
The average time of operation was 3. 5 hours． The number of lymph nodes was 6. 5． The average time of opening thorax was 6. 8 min． The
average time of closing thorax was 17. 4 min． The mean duration of postoperative chest tube draining was 3. 75 d． The hospital stay was
8. 32 d． Pain level of postoperative:stage 1 for 56 cases，stage 2 for 1 cases，stage 3 for 1 case． Three patients have complication of post-
operative． Conclusion Minimally invasive incision below the axilla in treatment of chest tumor has minimal injury，short recovery time
and little pain． It should be widely used．
【Key words】 Minimal invasive incision below axilla;Chest cancer
作者单位:650032 云南 昆明，成都军区昆明总医院心胸外科
由于人类生活习惯以及环境的不断变化，恶性肿瘤的发
病率呈明显上升趋势，其中以胸部肿瘤为甚［1］。胸部肿瘤主
386临床肺科杂志 2012 年 4 月 第 17 卷第 4 期