全 文 ：三叶青提取物对白血病 HL60细胞增殖抑制作用研究
徐彩菊 1　吴平国 1　姚亚萍 1　孟佳 1　鹿伟 1　陈玉满 1　白宁宁 2　丁钢强1
【摘要】 目的　探讨三叶青提取物对白血病 HL60细胞的增殖 、 凋亡的影响。方法　将不同浓度的受试物作用于体外培养
的 HL60细胞 , 用四氮唑蓝比色法 (MTT)检测细胞生长抑制率 , 应用流式细胞仪观察细胞凋亡。结果　受试物处理 24h后
6.25、 12.50、 25.00、 50.00、 100.00μg/ml组 , 受试物处理 48、 72h后所有浓度组 HL60细胞的增殖率和凋亡率均呈不同程度
的下降或上升 , 差异均有统计学意义。结论　三叶青提取物能有效抑制体外 HL60细胞的增殖 , 诱导 HL60细胞凋亡。
【关键词】 三叶青提取物;白血病细胞 HL60;细胞增殖;细胞凋亡
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号: 1007-0931 (2011) 04-0020-03
AStudyonInhibitoryEffectofExtractsfromTetrastigmaHemsleyanumDielset.GilgonProliferationofHL60CelLine
XuCai-ju, WuPing-guo, YaoYa-ping, etal.TheCenterforDiseaseControlandPreventionofZhejiangProvince, Hangzhou, Zhejiang,
310051, China.
【Abstract】Objective　ToinvestigatetheinhibitoryefectofextractsfromTetrastigmaHemsleyanumDielset.Gilg(TDG)onhuman
leukemiaHL60cels.Methods　VariousconcentrationsofextractsfromTDGweregiventoHL60celsinvitro.Theinhibitoryratioofthe
celswasmeasuredbyMTTasay.Theapoptosiswasobservedbyflowcytometry(FCM).Results　Alconcentrationsoftheextractsfrom
TDGcouldinhibitthegrowthofHL60celsandinduceapoptosis.Conclusion　TheextractsfromTDGcansignificantlyinhibitproliferation
ofHL60celsandinduceapoptosis.
【Keywords】Extractsofthetetrastigmahemsleyanumdielset.gilg;LeukemiaHL60celline;Celularproliferation;Apoptosis
基金项目:浙江省中医药科研基金项目 (2006C151)
作者单位:1.浙江省疾病预防控制中心毒理所 , 浙江
杭州　310051;2.湖南科技大学
　　历经几千年的民间使用 , 筛选出了大量高效低
毒的中草药 , 这些都是我们中华民族的瑰宝。在当
今回归自然的世界潮流中 , 国际医药界正在进行一
场扩大天然药物使用的 “绿色革命”。中药作为主
要的天然药物 , 其开发与应用正成为世界各国医药
产品发展的方向之一 。而我国生产的中药科技含量
较低 , 于是形成了好原料 、 粗加工的药品贸易格
局 , 而且许多中草药的功效成分及其作用机理至今
未被发掘 , 这就大大影响了我国中草药产业链的发
展 。因此 , 采用现代科学的方法发掘古方 , 不断探
索其新的功效 、 有效成分及其作用机理 , 提高本土
中药的科技附加值 , 从而研制和开发出更安全有效
的国际性新药来解决现代医学尚未解决的医学难题
就成了当前迫切需要解决的热点问题 。三叶青作为
中药在民间已有较长的服用历史 , 目前临床上往往
将三叶青与其他中草药配伍使用治疗恶性肿瘤病
人 , 具有较好的疗效 [ 1] 。三叶青为中国特有植物
物种 , 目前浙江省已基本解决了组培快繁技术 [ 2] ,
为三叶青大规模种植创造了条件 。
我们前期的研究结果表明三叶青乙酸乙酯提取
物具有增强正常小鼠免疫力的作用[ 3] , 三叶青提
取物对 S180荷瘤小鼠具有抑瘤作用 [ 4] 。我们的预
实验结果表明 , 三叶青另一种提取物 (酚类化合
物)对白血病细胞非常敏感。本文通过三叶青提
取物对体外培养的白血病 HL60细胞增殖抑制作用
及其诱导细胞凋亡作用 , 观察其体外抗白血病作
用 , 为三叶青临床应用提供实验依据 , 同时也将为
拓展三叶青的药用范围 , 提高其作为 “绿色药物 ”
的科技附加值 , 促进浙江省地方经济的可持续发展
打下良好的基础。
材料与方法
1　材料　
1.1　三叶青提取物　三叶青块根用 75.00%的酒
精提取 , 低温真空后得浓缩液 , 浓缩液经乙酸乙酯
提取物再经柱层析分离 , 冰冻干燥后得到的样本 ,
即为本次实验的受试物 , 4 ℃冰箱保存备用。
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1.2　细胞系　HL60细胞由浙江大学附属第一医
院血液科惠赠。
1.3　主要试剂　胎牛血清 (Bs), 美国 HYCLONE
公司产品;RPMI1640培养基 , 美国 GIBGO公司产
品;四甲基偶氮唑盐 (MTT), 美国 Mluka公司产
品;AnnexinⅤ / PIKIT, 美国 BD公司产品等。
1.4　主要仪器 　显微镜 (CH 30 型 , 日本
Olympus公司)、 倒置显微镜 (LeicaDMIL型 , 德
国 Leica351公司)酶标仪 (MultiskanMK3, 上海
雷勃 分 析 仪 器 有 限 公 司 )、 流 式 细 胞 仪
(Facscalibur, 美国 BD公司)、超净台 (SW-CJ-
2FD型 , 苏州净化设备有限公司)、 CO2培养箱
(2323-2型 , 美国 SHELLAB公司)、 高压灭菌消
毒器 (TOMYSS-325, 日本 TOMY公司)等。
1.5　细胞培养 　将 HL60细胞接种于 RPMI1640
培养液中 (含 10%胎牛血清 , 100 U/ml青霉素 、
链霉素), 37 ℃, 5% CO2饱和湿度下常规培养 。
每 2 ～ 3天换液传代。
2　方法
2.1　细胞增殖抑制实验 [ 5] 　取处于对数生长期的
HL60细胞进行细胞增殖抑制实验 。将 HL60细胞
浓度调整为 2×106个 /ml。对照组:常规培养;受
试物组:在 96孔板培养体系中加入不同浓度的受
试物 (终浓度分别为 0、 3.13、 6.25、 12.50、
25.00、 50.00、 100.00 μg/ml), 分别在培养第
24、 48、 72 h取样 , 上酶标仪 (波长 570 nm)测
定 。根据测定的吸光值观察不同药物浓度作用不同
时间对细胞增殖的影响。实验重复 3次 , 取均值 。
细胞增殖率 (%) = (实验孔 A值 -空白孔 A
值)/ (对照孔 A值 -空白孔 A值) ×100 %。
2.2　细胞凋亡实验　给不同浓度受试物 (终浓度
分别为 0、 1.56、 3.13、 6.25 μg/ml), 24 h后 ,
分别取一定数量的 HL60细胞洗涤 、 离心后 , 按细
胞凋亡测定试剂盒说明书进行操作 , 然后进行流式
细胞仪检测 , 用 CelQuest分析软件对各样本进行
细胞早期凋亡分析。实验重复 3次 , 取均值。
3　统计分析 　全部数据经 Sin-1 P1/2转换 , 采用
SPSS11.5统计软件进行分析 , 多组间比较采用方
差分析 , 两两比较采用 q检验。
结　果
1　HL60细胞增殖率检测结果　与对照组比较 ,
受试物处理 24 h后 6.25、 12.50、 25.00、 50.00、
100.00μg/ml组 , 受试物处理 48、 72 h后所有浓
度组 HL60细胞的增殖率均呈不同程度的下降 , 差
异均有统计学意义 (P<0.01), 见表 1。
表 1　HL60细胞增殖率检测结果
(%, x±s)
受试物浓度
(μg/ml) 24h 48h 72h
　0.00 100.0 100.0 100.0
　3.13 97.6±3.1 　 95.8±3.8＊＊ 87.2±8.2＊＊
　6.25 96.7±2.2＊＊ 65.7±6.1＊＊ 59.1±9.7＊＊
12.50 58.8±1.2＊＊ 41.0±2.9＊＊ 35.9±1.8＊＊
25.00 40.9±3.3＊＊ 33.5±4.2＊＊ 26.6±3.3＊＊
50.00 32.6±0.2＊＊ 21.1±0.4＊＊ 16.1±0.5＊＊
100.00 33.5±2.3＊＊ 21.9±1.1＊＊ 16.9±1.3＊＊
F 117.471 156.656 96.951
P 　0.000 　0.000 0.000
　注:＊＊与对照相比 , P<0.01
2　HL60细胞凋亡率检测结果 　与对照组比较 ,
受试物处理 24 h后 6.25、 12.50、 25.00、 50.00、
100.00μg/ml组 , 受试物处理 48、 72 h后所有浓
度组 HL60细胞的早期凋亡率均呈不同程度的上
升 , 差异均有统计学意义 (P<0.01), 见表 2。
表 2　HL60细胞凋亡率检测结果
(%, x±s)
受试物浓度
(μg/ml) 24h 48h 72h
　0.00 1.9±0.1　 2.1±0.3 　 5.1±1.1　
　3.13 3.2±0.4　 5.8±0.9＊＊ 12.1±1.9＊＊
　6.25 10.0±1.4＊＊ 10.2±2.8＊＊ 23.9±3.1＊＊
12.50 19.2±2.3＊＊ 21.2±2.7＊＊ 28.5±2.7＊＊
25.00 26.7±2.3＊＊ 27.2±0.7＊＊ 34.0±1.6＊＊
50.00 28.4±1.2＊＊ 31.2±1.8＊＊ -
100.00 30.0±1.9＊＊ 31.3±1.0＊＊ -
F 170.397 107.328 65.744
P 　0.000 　0.000 0.000
　注:＊＊与对照相比 , P<0.01
讨　论
当细胞生长受抑制时 , 本身状态不允许凋亡出
现;但当细胞内环境发生变化 , 诸如出现大量促生
长因子时 , 细胞面对反差巨大的互相矛盾的传递信
号 , 可能选择凋亡的出路 , 也因此将生长抑制与凋
亡 2种代谢过程表面化地联系在一起。细胞凋亡是
一种由基因控制的细胞自主性死亡方式 。英国阿伯
丁大学病理学教授 Ker于 1972年首先提出凋亡的
概念。 70年代后期 , 细胞凋亡与肿瘤发生的关系受
到了重视 。细胞生长与死亡之间的动态平衡是维持
组织细胞内环境稳定的重要因素 , 如果失去平衡 ,
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如抑制细胞凋亡使癌突变的细胞获得生存机会 , 其
通过生长优势筛选而最终发展成肿瘤。因此 , 促进
肿瘤细胞的凋亡在很大程度上能抑制肿瘤的发展。
细胞凋亡的途径主要有 3条 , 即线粒体途径 、
DNA损伤途径和膜受体途径 [ 6] 。线粒体是真核细
胞内的一种重要和独特的细胞器 , 是细胞内的能量
工厂。它通过氧化磷酸化作用进行能量转换为细胞
提供进行各种生命活动所需要的能量 。近年来的研
究表明 , 线粒体是细胞凋亡过程中关键的细胞器 。
本次研究中细胞增殖抑制试验采用 MTT比色法 。
MTT法的基本原理是活细胞线粒体内活性脱氢酶
可将 MTT还原为紫色的甲腊 (formazan), 且细胞
的存活数与其产生的甲腊的 OD值之间存在线性关
系 。本次实验结果显示 , 受试物能明显抑制 HL60
细胞的增殖 , 因此进一步证实了受试物可干扰
HL60细胞代谢 , 导致其线粒体功能障碍 。
进一步对我们的研究结果分析发现 , 受试物处
理 24h后 , 除 3.13μg/ml浓度组外 , 其余各浓度
组 HL60细胞的增殖率和凋亡率与对照组比较差异
均有统计学意义 , 两者均具有剂量和时间依赖性趋
势 , 结果基本一致 , 因此初步认为其诱导 HL60细
胞凋亡可能也是通过线粒体途径。本次结果中出现
3个时间点的 100.00与 50.00 μg/ml浓度组 HL60
细胞的增殖率基本相近现象 , 可能与受试物在高浓
度的溶解度有关 。受试物处理 72 h后 , 在 50.00
与 100.00 μg/ml浓度组由于绝大部分细胞死亡后
分解成碎片 , 因此无法对其进行凋亡分析。
综上所述 , 三叶青提取物能诱导 HL60细胞凋
亡 , 有效抑制体外 HL60细胞的增殖 , 其作用机制
有待进一步的研究 。
参考文献
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京:科学出版社 , 2008: 142.
(收稿日期:2010-12-13)
(上接第 10页)
反映机体的铅代谢水平 , 在高浓度铅暴露情况下 ,
机体的铅代谢水平出现了下降趋势。
DNA损伤水平与铅暴露工人工龄无相关性 ,
说明 γH2AX抗体识别 FCM检测 DNA损伤具有即
时性 , γH2AX作用是募集 DSBs修复蛋白 , 当
DNA完成修复 γH2AX也会消失 , 人体内 DNA损
伤和修复存在动态平衡 。实验结果显示 , FCM对
低暴露组 DNA损伤水平敏感性高 , YuYanke等比
较彗星实验和 γH2AX荧光焦点实验发现 γH2AX
可以检测更低剂量毒物所致 DNA损伤 [ 5] , 提示
γH2AX-FCM可用于职业危害因素早期接触 、低
暴露和对职业危害因素敏感工人的筛选 , 具有重大
利用价值。
由于 FCM步骤简单 , 易于操作 、 结果客观 ,
可作为 DNA损伤检测的快速简捷方法运用 , 并在
早期筛选和个体差异性评价具有重大利用潜力 。
参考文献
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(收稿日期:2010-10-09)
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