全 文 ：文章编号:1002-8110(2005)02-0044-03
MS -HPLC法检测啤酒酵母胞内代谢有机酸的变化
王世崇1 , 3 ,赵长新1 ,孙付保1 , 2 ,任洪艳1, 2
(1.大连轻工业学院 生物与食品工程学院 ,辽宁 大连　116034;2.中科院过程工程研究所 生物化工国家重点实验室 ,北京　100080;
3.大连华润啤酒有限公司 ,辽宁大连　116033)
摘　要:通过啤酒酵母细胞的几种破壁方法比较 , 确定了微波破壁(MS , microwave-split)和高效液相色谱
(HPLC)联用的方法 , 对通风发酵过程中啤酒酵母细胞胞内六种有机酸含量的动态变化 , 进行了定性定量跟踪
检测。本方法具有前处理简单 、干扰小 、分析速度快等优点 , 便于及时跟踪测定发酵过程中有机酸的动态变
化。研究结果表明通风发酵过程中 ,胞内作为经济性碳底物的柠檬酸和琥珀酸含量很低 ,代谢变化调控严格;
其余四种有机酸在发酵后期阶段有机酸含量变化对 K+、Ca2+两种离子响应不同。
关键词:微波破壁;高效液相色谱法;啤酒酵母;有机酸;动态变化
中图分类号:TS262.5;TS261.11　　　　文献标识码:B
　　酵母细胞产生的有机酸跨膜运输是酵母本身维持生存 、
协调内外界环境的结果。由于外界渗透压 、电化学梯度和胞
内酸等代谢产物的积累 ,酵母在一定的生理阶段会发生酸外
排的行为;同样 , 当外界营养碳底物不足 、能量不充分或者生
理代谢相关酶活降低造成中间底物缺乏时 ,就会产生酸回归
胞内的现象。鉴于此 , 本文应用微波间歇法破壁(MS)和高
效液相色谱(HPLC)技术来检测不同时期通风发酵培养的啤
酒酵母细胞内产柠檬酸 、苹果酸 、琥珀酸 、酒石酸 、冰乙酸和
乳酸等的有机酸含量 , 开展胞内有机酸动态变化的研究 , 以
便进一步探讨酵母细胞胞内产有机酸的代谢规律。
1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　菌种
啤酒酵母 ,由大连华润啤酒有限公司提供
1.1.2　发酵培养基
蔗糖 100g ,蛋白胨 10g , NH4H2PO42g ,MgSO4.7H2O 492mg ,
Na2HPO4895.4mg ,加去离子水 1000mL , KH2PO4、CaCl2含量
收稿日期:2004-10-19
作者简介:王世崇(1963-), 男 , 辽宁鞍山人 ,高级工程师 , 主
要从事啤酒品质的研究和开发。
基金项 目:辽宁 省教 育厅 高 校科 研基 金资 助项 目
(20207010930)3.9mm ×300mm;预分离柱:C18 填料 , Sep -
PakC18(S-P柱 ,国产);
如表 1 所示。
表 1 培养基中两种离子的含量
①号 ②号
KH2PO4(g) 6.804 13.610
CaCl2(mg) 277.4 66.39
1.1.3　试验仪器
超高速冷冻离心机(B-22M), Thermo IEC;台式微波炉
(National-NN -K580MFS), 上海松下微波炉有限公司;0.
22μm 针筒式水膜过滤器 , 大连依利特公司;高效液相色谱仪
(Jasco , Japan),μBondapak C18 柱(Jasco , Japan):10μm×φ
1.1.4　试剂
流动相:0.01M KH2PO3 水溶液 , pH2.65(磷酸调节), 用
0.45μm 孔径的合成纤维素酯滤膜进行真空超滤 , 超声波脱
气 20min。
标准有机酸:酒石酸 、柠檬酸 、琥珀酸 、苹果酸 、乙酸和乳
酸均为色谱纯或分析纯;超纯水:娃哈哈纯净水经 0.45μm 孔
径的合成纤维素酯滤膜进行真空超滤而成。
1.2　实验方法
1.2.1　菌体培养
参照文献[ 1]
1.2.2　还原糖的测定
同参考文献[ 1]
　　表 1
时间(年) 平均利用率(%)
1997—1999 53
1999—2000 78
2001—2003 94
　　由此可见 ,稳定 、优质的轮次基酒不仅是决定成品酒质
量 、档次和形成酒体风格的重要基础 , 更是企业经济效益的
“源泉” 。鉴于认识水平的局限 , 以上纯属个人体会 , 重在相
互交流和学习。
图 1　基酒利用率示意图
第32卷　第 2期
2 0 0 5 年 3 月　　　　　　　　　　　　　　　　　　
酿　　酒
LIQUORMAKING
　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.32 , No.2
Mar., 　2005
1.2.3　发酵液预处理
取20mL发酵液 , 迅速于 5℃, 18 , 000rpm 超高速冷冻离
心10min。酵母沉淀物用用去离子水反复洗涤离心 3 次后 ,
10mL水转入 50mL小三角瓶中以进行微波破壁。
1.2.4　酵母细胞的微波破壁[ 2 ,3]
把处理过的待破壁样品放入微波炉中 ,破壁采用 20s×4
间歇式进行。间隔时间以小三角瓶降温到室温为宜。 破壁
完毕后用去离子水恢复定容到与原发酵液等体积。然后充
分搅拌后静置 30min ,以使胞内物充分溶出 ,胞液溶解均匀。
破碎液再超高速离心 18 , 000rpm , 10min 后 ,上清液存样以便
进行有机酸的HPLC定性定量分析。
1.2.5　高效液相色谱法(HPLC)对有机酸的测定[ 4 ,5]
色谱条件:流速为 0.7mL/min;监测器波长:215nm;柱
压:100KPa;柱温:室温;灵敏度:0.04;进样量:20μL/次。
有机酸标准溶液的配制:精确配制标准酒石酸 、苹果酸
溶液各 1mg/mL ,乙酸 0.5mg/mL, 柠檬酸 、琥珀酸和乳酸各为
2mg/mL。用超纯净水溶解并定容至刻度。然后经不同浓度
的稀释 ,配制成有机酸标准混合溶液。
标准有机酸和酵母细胞经破碎处理后的上清液 ,均用一
次性无菌注射器(2mL)配合 0.22μm 的针筒式水膜过滤器直
接进样。
2　结果与分析
2.1　啤酒酵母细胞不同破碎方法的比较
2.1.1　冷冻-煮沸处理
取 5mL发酵液以 18 , 000rpm 离心 5min , 去离子水洗三次
得到湿菌体 , 加去离子水震荡摇匀后 , 定容到 5mL。放入沸
水浴中煮沸 15min ,冰箱冷冻后再煮沸 , 反复三次 , 恢复定容
到5mL, 充分震荡 30min。进行镜检观察。 然后超高速 18 ,
000rpm 冷冻离心 5min ,弃去沉淀 , 取上清液以去离子水作空
白对照 ,用紫外分光光度计测 A260和 A280 。
2.1.2　研磨法
将100mL发酵液经上述一样离心处理的菌体沉淀在
50℃下烘干至恒重 , 置于研钵中加入石英砂 ,研磨 60min 得
到破碎细胞。然后用去离子水恢复定容到 100mL , 充分振荡
30min ,以使胞内溶物充分溶出 ,进行镜检观察。然后以 18 ,
000rpm 离心 5min ,上清液进行测 A260和 A280 。
2.1.3　冷冻研磨法
将上述同样类似的方法处理菌体后 ,置于研钵中加入少
许液氮 ,立即研磨 5min 得到破碎细胞 , 同样恢复定容后充分
溶解均匀 30min 后 ,镜检观察。然后离心以测 A260和 A280 。
2.1.4　微波破壁法
同前面所述 ,处理完毕后破碎液由原来的无色无味浑浊
液转变成淡黄或乳黄色 、呈有酵母香味的粘稠物。 同样离
心 ,测上清液的 A260和 A280。
下面是酵母细胞几种破碎方法的比较:对处于相同发酵阶
段发酵液中的酵母细胞 ,选用几种不同的方法进行破壁 ,然后离
心分离,通过检测上清液中的蛋白质含量[6]来测定细胞破碎程
度,从而确定一种适合测定胞内有机酸的破壁方法。测定时用
1.45 A280-0.74 A260表示上清中蛋白含量。以上几种破碎方法
测定结果的比较如图 1所示。结果表明,冷冻研磨和微波法是
很不错的方法:破碎程度高 ,劳动强度小 ,短时高效。但冷冻研
磨要求每次取样液太多 ,而且研磨时人为误差大 ,稳定性差, 样
品易损失等。鉴于此 ,采用微波破壁法。
图 1　不同细胞破碎方法的比较
2.2　外标工作结果
表 2 6 种标准有机酸的线性方程
有机酸种类 保留时间(min) 回归方程 线性相关系数
酒石酸 3.893 y=3209.8x-9417.7 R2=0.9997
苹果酸 5.133 y=1529x-9835.8 R2=0.9996
乳　酸 6.120 y=728.07x-5611.6 R2=0.9993
冰乙酸 6.707 y=2942.2x-9142.5 R2=0.9992
柠檬酸 10.453 y=1833.7x-30278 R2=0.9997
琥珀酸 11.787 y=41.212x+2338.9 R2=0.991
　　吸取 6种有机酸标准溶液分别进样 ,它们的保留时间 、
回归方程和线性相关系数见表 2。分别吸取 8个不同浓度的
6种有机酸标准混合液进样 , 6 种有机酸在 13min 内完成分
离 ,表 2 和它的标准色谱图(略)可以看出 , 6 种标准有机酸
的检测效果非常好 , 表明该条件下完全可以用于啤酒酵母通
风条件下有机酸的含量分析。
图 2　①号发酵 12h时 5种胞内有机酸的HPLC图谱
其中的①号培养基发酵 12h 时啤酒酵母细胞胞内有机
酸含量的 HPLC色谱分析如图 2 所示:①号培养基通风发酵
12h 时 ,没有检测到琥珀酸 , 表明在发酵初期啤酒酵母代谢
产琥珀酸时 ,可能存在着经济节俭和精确保守的特点 , 琥珀
酸代谢存在着非常严格的生理调控。
2.3　啤酒酵母胞内有机酸的动态变化
①、②号两种离子培养基通风发酵过程中 , 啤酒酵母胞
内 6 种有机酸含量动态变化如图 4 , 5 和表 3 所示。
·45·第 2期　　　　　　王世崇 ,等:MS-HPLC法检测啤酒酵母胞内代谢有机酸的变化　　　　　　　　　　
图 3　①号培养基四种有机酸的变化
图 4　②号培养基四种有机酸的变化
如图 3 , 4 所示:酒石酸 、苹果酸 、乳酸和冰乙酸有着非常
相似的动态走势 ,显现出它们对 K+、Ca2+等离子有着近乎相
同的响应 , 表明在 K+、Ca2+等离子的协同作用下 ,胞内这四
种有机酸的代谢机理基本上是相同的。但发酵后期(72-
96h)阶段 , 四种有机酸对 K+、Ca2+等离子的响应却明显不
同:①号培养中 4 种有机酸含量随培养时间增加明显减少 ,
而②号培养中四种有机酸含量随培养时间增加却明显增加。
这表明不同含量的K+、Ca2+两种离子间相互作用的结果对
酵母生理代谢产酸的影响是不同的 ,同时也印证了离子与啤
酒酵母生理代谢相关性的结论[ 7] 。 至于离子是如何影响酵
母生理代谢产酸的 ,有待于作更深入的研究。
　　通风发酵培养时 , 啤酒酵母细胞内柠檬酸和琥珀酸含量
变化如表 3。表3 表明 , 胞内柠檬酸和琥珀酸含量很低 ,几乎
不存在 , 偶尔存在又很快被代谢。初步推测这两种酸在酵母
细胞内代谢变化非常迅速的原因可能是 , 这两种酸代谢存在
着惊人的精确保守性和经济节俭性 , 说明酵母细胞对这两种
酸的代谢有着非常严格的代谢调控机制。
　　表 3　两种培养中柠檬基酸和琥珀酸的变化
培养时间
(h)
①号培养基
柠檬酸
(μg/mL)
琥珀酸
(μg/mL)
②号培养基
柠檬酸
(μg/mL)
琥珀酸
(μg/mL)
12 38.7 2.6 13.4 未检出
24 149.5 未检出 25.7 7.6
36 41.3 1.0 128.3 1.3
48 未检出 未检出 未检出 2.7
60 3.3 未检出 5.1 未检出
72 未检出 1.6 未检出 3.5
84 159.9 未检出 3.4 1.3
96 87.4 1.1 未检出 未检出
3　结论
本文建立微波破壁和高效液相(MS-HPLC)色谱分析酵
母细胞内有机酸含量的方法简便 、快速 , 便于及时跟踪测定
发酵过程中有机酸的动态变化。啤酒酵母细胞胞内柠檬酸
和琥珀酸含量很低 , 代谢变化调控严格;其余四种有机酸在
发酵后期阶段有机酸含量变化对 K+、Ca2+两种离子响应不
同。
[ 参考文献]
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微波破细胞提取[ J] .过程工程学报 , 2001 ,3(1):324-327.
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Metabolic Changes of Organic Acids in Beer Yeast Determined by MS-HPLC
WANGShi-chong1 , 3 , ZHAO Chang -xin1 , SUN Fu-bao1 ,2 , REN Hong -yan1 ,2
(1.College of Bio&food Technology , Dalian Institute of Light Industry , Dalian , Liaoning116034, China;2.State Key Laboratory of biochemical Engineering ,
Institute of Process Engineering , Chinese Academy of Sciences, Beijing100080, China;3.Dalian Huarun Beer Co., Ltd , Dalian , Liaoning116033 , China)
ABSTRACT:With the comparison of several cell disruption methods of beer yeast , the technology of MS(microwave-split)-HPLC was de-
veloped to determine and analyze dynamic changes of six organic acids metabolized in the inner cell of beer yeast.The method was simple ,
fast and convenient to monitor in time dynamic changes of organic acids.The results showed that under aerobic fermentation , there were low
concentration and rather strict metabolic manipulation mechanism for citric acid and amber acid as carbon substrates;and the other four re-
sponded differently to K+、Ca2+in the late stage.
KEY WORDS:Microwave-split;HPLC;beer yeast;organic acid;dynamic change
·46·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　酿　　酒　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2005