全 文 ：食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
182 2011 Vol. 37 No. 2 (Total 278)
柱前衍生超高效液相色谱法测定核桃仁中的氨基酸含量*
杨俊，王文辉，李翼，王齐，孙晓东，朱艳琴
(昆明理工大学分析测试研究中心，云南省分析测试中心，云南 昆明，650093)
摘 要 建立超高效液相色谱法(UPLC)测定核桃仁中氨基酸的含量。文中采用 Waters Acquity UPLC BEH C18
色谱柱(2. 1 mm × 150 mm，1. 7 μm)，AccQ. Tag Ultraa Eluent A 及 AccQ. Tag Ultraa Eluent B 梯度洗脱，流速为
0. 7 mL /min，波长 248 nm，柱温 55℃。结果显示:17 种氨基酸在 0. 003 ～ 0. 18 mg /mL内有良好的线性关系(r ＞
0. 999 4)，平均回收率(n = 6)为 98. 5%。该方法 10 min内 17 种氨基酸能够完全分离，具有快速、准确、重复性好
的特点。
关键词 超高效液相色谱(UPLC)，氨基酸，核桃仁，含量测定
第一作者:学士，工程师。
* 昆明理工大学分析测试研究中心主任基金(2008 － 002 )
收稿日期:2010 － 03 － 30，改回日期:2010 － 12 － 01
核桃(Juglans sigillata Dode) ，又名胡桃、羌桃，为
胡桃科胡桃属落叶乔木的果实。其果仁(核桃仁)营
养丰富，含有丰富的蛋白质、脂肪，矿物质和维生素。
核桃仁中含有 18 种重要的氨基酸，其中，人体必需氨
基酸检测出 8 种，即苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨
酸、苯丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸［1］。我国核桃年产量
为 50 万 t，占世界核桃产的 30%以上，是世界核桃
第一产量大国，因此可以说，核桃是中国重要的植物
优质蛋白源。
超高效液相色谱(UPLC)技术是近年来发展较
快的新型液相色谱检测技术，由于采用了 1. 7 μm 颗
粒度的色谱柱填料，因此能够获得更高的柱效，并且
在更宽的线速度范围内柱效保持恒定，有利于提高流
动相流速、缩短分析时间和提高分析通量。相对于传
统的高效液相色谱法(HPLC)而言，UPLC 具有更好
的分离效率、峰容量以及灵敏度，为复杂体系的分离
分析提供了良好的技术平台。
目前应用于氨基酸分析的主要方法有柱后衍生
高效阴离子交换色谱法［2］、柱前衍生反相高效液相
色谱法［3］、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测
法［4］，以上这些方法的分析时间都需要 45 ～ 120 min，
分析时间较长［5］，本文采用柱前衍生 UPLC 法测定核
桃中的氨基酸含量，对测定条件进行优化，比常规
HPLC法省时 30 ～ 40 min，且灵敏度高，准确性好，是
一种简便、快速、准确的检测方法 .
1 仪器和试剂
美国 Waters ACQUITY Ultra Performance LC 系
统，ACQUITY UPLC(r)紫外检测器，Waters Empower
2 色谱数据工作站，17 种氨基酸水解标准溶液(美国
Waters公司提供) ，AccQ. Tag Ultra Eluent A(醋酸盐
缓冲溶液 pH = 5. 2，美国 Waters 公司提供) ，Ac-
cQ. Tag Ultraa Eluent B(60%乙腈，美国 Waters 公司
提供) ，Waters AccQ-Fluor 试剂盒［包括硼酸缓冲液
1、衍生剂粉 2A(6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基
甲酸酯)、稀释液 2B(乙腈) ，美国 Waters公司提供］，
乙腈(美国 Fisher公司，色谱纯)。
水为超纯水，核桃(购自昆明金马正昌果品批发
市场)。
2 试验方法
2. 1 色谱条件
色谱柱:Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱
(2. 1 mm × 100 mm，1. 7μm) ;紫外检测波长:248
nm;柱温 55℃;梯度洗脱见表 1。理论塔板数以谷氨
酸不低于 5 000。
表 1 梯度洗脱
时间 /
min
流速 /
(mL·min －1)
A体积
分数 /%
B体积
分数 /%
曲线
0
0. 54
5. 74
7. 74
8. 04
8. 64
8. 73
9. 5
0. 7
0. 7
0. 7
0. 7
0. 7
0. 7
0. 7
0. 7
99. 9
99. 9
90. 9
78. 8
40. 0
40. 0
99. 9
99. 9
0. 1
0. 1
9. 1
21. 2
60. 0
60. 0
0. 1
0. 1
6
7
6
6
6
6
6
6
注:A，取 AccQ. Tag Ultraa Eluent A 50 mL加入超纯水 950 mL;B，
AccQ. Tag Ultraa Eluent B。
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2011.02.046
分析与检测
2011年第 37卷第 2期(总第 278期) 183
2. 2 氨基酸标准使用液的制备
取 1 支 Waters 氨基酸标准水解溶液，打开后吸
取 1 mL，放至一支干净的 25 mL 试管中，加 9. 0 mL
超纯水，旋涡混匀备用。浓度见表 2 所示。
2. 3 衍生试剂制备
将烘箱预热至(55 ± 1)℃，取一瓶衍生剂粉 2A，
轻轻敲动以确保打开前所有粉在瓶底，吸取 1 mL 稀
释液 2B 并弃去以冲洗一个干净的微量移液吸头，移
1 mL 稀释液 2B 至 2A 瓶中，盖紧瓶盖，旋涡混匀
10 s，55℃加热 5 ～ 10 min使衍生剂粉溶解(加热不得
超过 10 min)。将溶解后的衍生试剂放入干燥器中，
可在室温保存 1 w。
表 2 氨基酸使用液浓度
名称
相对分子
质量
浓度 /
(mg·mL －1)
名称
相对分子
质量
浓度 /
(mg·mL －1)
天门冬氨酸(Asp) 133. 10 0. 033 28 胱氨酸(Cys) 240. 30 0. 0300 4
丝氨酸(Ser) 105. 09 0. 026 27 酪氨酸(Tyr) 181. 19 0. 0453 0
谷氨酸(Glu) 147. 13 0. 036 78 缬氨酸(Val) 117. 15 0. 0292 9
甘氨酸(Gly) 75. 067 0. 018 77 蛋氨酸(Met) 149. 21 0. 0373 0
组氨酸(His) 155. 15 0. 038 79 赖氨酸(Lys) 146. 19 0. 0365 5
精氨酸(Arg) 174. 20 0. 043 55 异亮氨(Ileu) 131. 17 0. 0327 9
苏氨酸(Thr) 119. 12 0. 029 78 亮氨酸(Leu) 131. 17 0. 0327 9
丙氨酸(Ala) 89. 093 0. 022 27 苯丙氨(Phe) 165. 19 0. 0413 0
脯氨酸(Pro) 115. 13 0. 028 78
2. 4 氨基酸标准使用液的衍生
将烘箱预热至(55 ± 1)℃;用微量进样器吸取 10
μL氨基酸标准使用液至一支干净的样品管底部，移
70 μL硼酸缓冲液至样品管中，短暂旋涡混匀，移 20
μL衍生试剂至样品管中，立即旋涡混匀数秒种，室
温放置 1 min;用封口膜封口，55 ℃加热 5 min即可。
2. 5 样品溶液的制备
精密称取经室温自然晾干并粉碎均匀的核桃仁
粉约 50 mg，置干燥洁净的安瓿瓶中，加 2 mg 苯酚
(精制) ，加 6 mol /L HCl 溶液 2 mL，充氮，迅速将充
好 N2 的安瓿瓶瓶口置于酒精喷灯上封口，置 110 ℃
烘箱中水解 24 h，打开安瓿瓶，取 1 mL水解液移入蒸
发皿中，蒸干，残渣用水分次洗涤，合并洗涤液，滤液
移至 10 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品
溶液。
2. 6 样品溶液的衍生
吸取供试品溶液约 1 mL，通过 0. 22 μm 微孔滤
膜过滤，吸取 10 μL滤液按 2. 4 以下同法操作。进样
量 1 μL。
3 结果与讨论
3. 1 系统适用性试验
将样品溶液及氨基酸标准使用液依次进样，得色
谱图(图 1) ，从图 1 中可看出，17 种氨基酸完全分
离。
图 1 氨基酸标准品(A)和核桃仁样品(B)UPLC色谱图
3. 2 线性关系考察
精密吸取对照品溶液 0. 1、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0 μL
按“2. 1”项下色谱条件进样进样，测定，以对照品溶
液质量浓度为横坐标(X) ，峰面积的为纵坐标(Y)绘
制标准曲线。详见表 3。
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
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表 3 氨基酸的检出限及线性范围
氨基酸 His Ser Arg Gly Asp Glu Thr Ala Pro
线性方程 y =2. 60x ×106 y =3. 93x ×106 y =2. 16x ×106 y =5. 41x ×106 y =3. 04x ×106 y =2. 60x ×106 y =3. 49x ×106 y =4. 59x ×106 y =3. 33x ×106
相关系数 0. 999 5 0. 999 6 0. 999 5 0. 999 6 0. 999 5 0. 999 5 0. 999 5 0. 999 6 0. 999 6
线性范围 /
(mg·mL －1)
0. 007 8 ～ 0. 156 0. 005 3 ～ 0. 105 0. 003 8 ～ 0. 075 0. 005 3 ～ 0. 105 0. 006 7 ～ 0. 133 0. 007 4 ～ 0. 147 0. 006 0 ～ 0. 119 0. 004 5 ～ 0. 089 0. 005 8 ～ 0. 115
检出限 /ng 0. 02 0. 02 0. 05 0. 06 0. 21 0. 38 0. 03 0. 02 0. 04
氨基酸 Cys Lys Tyr Met Val Ileu Leu Phe
线性方程 y =5. 48x ×106 y =4. 56x ×106 y =2. 39x ×106 y =2. 80x ×106 y =3. 60x ×106 y =3. 21x ×106 y =3. 12x ×106 y =2. 48x ×106
相关系数 0. 999 7 0. 999 6 0. 999 7 0. 999 7 0. 999 7 0. 999 4 0. 999 5 0. 999 4
线性范围
(mg·mL －1)
0. 003 0 ～ 0. 060 0. 007 3 ～ 0. 146 0. 009 1 ～ 0. 181 0. 007 7 ～ 0. 149 0. 005 9 ～ 0. 117 0. 006 6 ～ 0. 131 0. 006 6 ～ 0. 131 0. 008 3 ～ 0. 165
检出限 /ng 0. 27 0. 25 0. 07 0. 06 0. 12 0. 13 0. 15 0. 03
3. 3 稳定性试验
取所制备的 17 种氨基酸溶液，分别在 0、6、12、
24、36、48 h测定各氨基酸的峰面积，计算各氨基酸峰
面积的 RSD为 1. 12% ～ 1. 26%。结果表明，供试品
溶液在 48 h内稳定。
3. 4 重复性试验
取同一样品按 2. 5 方法制备 6 份样品溶液，分别
进样，测定 17 种氨基酸峰面积，计算含量，RSD 为
1. 0% ～1. 2%。
3. 5 回收率试验
精密称取已测知含量的核桃仁样品 25 mg，共 6
份，分别精密加入 17 种氨基酸水解标准溶液 0. 5
mL，按 2. 5 方法制备供试液并测定，计算平均回收率
为 98. 5%，平均 RSD =2. 1% 。详见表 4。
3. 6 样品含量测定
采用 2. 5 方法，对不同的核桃仁样品进行处理，
用 2. 1 色谱方法进行测定，各样品中的氨基酸的含量
测定结果见表 5。同时用国家标准方法(GB /T
5009. 124 － 2003 食品中氨基酸的测定)做对照实验，
表 6 为采用 UPLC 法和国家标准方法的结果比较。
从表 6 可以看出 UPLC 法和国家标准方法得到的氨
基酸的含量基本一致，证明本方法可靠性较好。
表 4 17 种氨基酸的回收率
氨基酸
原始含量 /
mg
加入量 /
mg
测得量 /
mg
回收率 /
%
相对标准偏差
(RSD)/%(n =6)
His 0. 045 0. 194 0. 234 0. 974 3. 2
Ser 0. 100 0. 131 0. 226 0. 962 1. 6
Arg 0. 265 0. 218 0. 482 0. 995 2. 6
Gly 0. 155 0. 094 0. 246 0. 968 3. 8
Asp 0. 330 0. 166 0. 493 0. 982 1. 1
Glu 0. 530 0. 184 0. 715 1. 005 2. 9
Thr 0. 080 0. 149 0. 226 0. 98 1. 0
Ala 0. 095 0. 111 0. 205 0. 991 1. 9
Pro 0. 323 0. 144 0. 465 0. 986 1. 6
Cys 0. 038 0. 150 0. 186 0. 987 1. 3
Lys 0. 118 0. 183 0. 299 0. 989 4. 3
Tyr 0. 130 0. 227 0. 356 0. 996 2. 2
Met 0. 048 0. 187 0. 232 0. 984 1. 6
Val 0. 155 0. 146 0. 298 0. 979 1. 8
Ileu 0. 105 0. 164 0. 267 0. 988 1. 4
Leu 0. 250 0. 164 0. 411 0. 982 2. 2
Phe 0. 155 0. 207 0. 361 0. 995 1. 6
表 5 核桃仁中氨基酸的测定结果
核桃 His Ser Arg Gly Asp Glu Thr Ala Pro
1 0. 18 0. 40 1. 06 0. 62 1. 32 2. 12 0. 32 0. 38 1. 29
2 0. 21 0. 48 1. 79 0. 53 0. 98 2. 81 0. 40 0. 42 1. 18
3 0. 20 0. 52 1. 82 0. 50 1. 29 3. 05 0. 41 0. 39 1. 23
4 0. 22 0. 44 1. 62 0. 53 1. 25 2. 56 0. 50 0. 51 1. 16
5 0. 21 0. 51 1. 58 0. 64 1. 59 2. 49 0. 56 0. 46 1. 20
6 0. 25 0. 55 1. 69 0. 46 1. 47 2. 23 0. 43 0. 50 1. 14
核桃 Cys Lys Tyr Met Val Ileu Leu Phe 总量
1 0. 15 0. 47 0. 52 0. 19 0. 62 0. 42 1. 00 0. 62 11. 68
2 0. 19 0. 38 0. 24 0. 14 0. 68 0. 51 1. 02 0. 61 12. 57
3 0. 17 0. 52 0. 35 0. 10 0. 57 0. 39 0. 95 0. 49 12. 95
4 0. 12 0. 49 0. 30 0. 16 0. 70 0. 55 0. 96 0. 58 12. 65
5 0. 16 0. 41 0. 36 0. 12 0. 69 0. 47 1. 06 0. 55 13. 06
6 0. 16 0. 45 0. 45 0. 11 0. 65 0. 43 1. 02 0. 57 12. 56
分析与检测
2011年第 37卷第 2期(总第 278期) 185
表 6 采用 UPLC法和国家标准方法的结果比较
方法
核桃仁中氨基酸的含量 /%
His Ser Arg Gly Asp Glu Thr Ala Pro Cys Lys Tyr Met Val Ileu Leu Phe
UPLC法 0. 18 0. 40 1. 06 0. 62 1. 32 2. 12 0. 32 0. 38 1. 29 0. 15 0. 47 0. 52 0. 19 0. 62 0. 42 1. 00 0. 62
国家标准
方法
0. 16 0. 43 1. 07 0. 60 1. 33 2. 12 0. 35 0. 37 1. 27 0. 19 0. 51 0. 54 0. 16 0. 59 0. 38 1. 01 0. 61
4 结论
本实验采用柱前衍生 UPLC 法对核桃仁样品中
的 17 种氨基酸的含量进行测定，10 min内 17 种氨基
酸能够完全分离。比常规的 HPLC 法缩短了 30 ～ 40
min，方法的准确度和精密度均较高。结果证明，UP-
LC法具有快速、高分离度等优势，将 UPLC 法替代
HPLC法测定核桃仁中氨基酸含量，准确、快速，灵敏
能提高色谱峰分离度，大大减少分析时间，提高工作
效率，减少溶剂损耗及废液处置费用，适用于核桃仁
中氨基酸的快速测定。
参 考 文 献
［1］ 郝艳宾，王克建，王淑兰，庄艳玲 . 几种早实核桃坚果中
蛋白质、脂肪酸组成成分分析［J］． 食品科学，2002，23
(10) :123 － 125．
［2］ 墨淑敏;梁立娜;蔡亚岐;牟世芬;温美娟 . 高效阴离
子交换色谱-电化学法测定酱油中的氨基酸［J］．分析试
验室，2006(5) :36 － 39．
［3］ 程显隆;肖新月;邹秦文;李广华;田守生 . 柱前衍生
化 HPLC法同时测定阿胶中 4 种主要氨基酸的含量
［J］．药物分析杂志，2008(12) :1 997 － 2 000．
［4］ 于泓;丁永胜;牟世芬 . 阴离子交换色谱-积分脉冲安
培检测法分离测定氨基酸注射液中的氨基酸和葡萄糖
［J］．分析化学，2002(5) :398 － 402．
［5］ 于泓，牟世芬．氨基酸分析方法的研究进展．［J］分析化
学，2005，33(3) :398 － 404．
Determination of Amino Acids in Walnuts by Ultra Pefformanace
Liquid Chromogray(UPLC)with Pre-column Derivation
Yang Jun，Wang Wen-hui，Li Yi，Wang Qi，Sun Xiao-dong，Zhu Yan-qin
(Research Center for Analysis and Measurement，Kuming University of Science and
Technology，Kunming 650093，China)
(Analytic and Testing Reseach Center of Yunnan，Kunming 650093，China)
ABSTRACT To establish an UPLC method in determination the amounts of Amino Acids in Walnuts． A Waters Ac-
quity UPLC BEH C18 column (2. 1 mm ×150 mm，1. 7μm)was applied，using AccQ． Tag Ultraa eluent A and AccQ．
Tag Ultraa eluent B as the mobile phase，with a flow rate of 0. 7 mL /min，and the column temperature 55℃ ． The cali-
bration curve was linear in the range of 0. 003 ～ 0. 18 mg /mL of Amino Acids (r ＞ 0. 999 4)． The average recovery of
Amino Acids was 98. 5% ． It has the advantage of simple，accuracy，and repeatable in the determination Amino
Acids．
Key words ultra performance liquid (UPLC) ，amino acids，kernel of walnut，quantitative analysis