全 文 ：收稿日期:2008-12-04
作者简介:王丽媛(1985), 女 , 在读硕士 , 主要从事农产品加
工及贮藏工程方面的研究工作(E-mail)lucky001caroline@
163.com。
通讯作者:仇农学 ,教授 , 博士生导师。
油料蛋白
杏仁蛋白 Alcalase水解工艺及其体外抗氧化活性的研究
王丽媛 ,仇农学 ,刘　宁
(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院 ,西安 710062)
摘要:为深入开发利用杏仁蛋白资源 ,采用 Alcalase蛋白酶水解杏仁蛋白 ,以水解度为指标对酶解过
程进行研究 ,在单因素试验基础上以水解度和 DPPH自由基清除率为指标进行酶解正交试验。结果
表明制备抗氧化能力较强的杏仁蛋白水解物的最佳条件为:pH8.0,温度 55℃,酶底比 4%,底物浓度
5%。在此条件下进行水解试验 ,水解度为 21.02%,水解物对 DPPH自由基的清除率为 66.13%。
关键词:杏仁蛋白;Alcalase蛋白酶;水解工艺;抗氧化性
中图分类号:TS229;TS202　　　文献标志码:A　　　文章编号:1003-7969(2009)07-0022-04
Enzymatichydrolysisofapricot(PrunusarmeniacaL.)kernelprotein
byAlcalaseanditsantioxidativeactivity
WANGLiyuan, QIUNongxue, LIUNing
(ColegeofFoodEngineeringandNutritionalScience, ShaanxiNormalUniversity, Xi an710062, China)
Abstract:Apricot(PrunusarmeniacaL.)kernelproteinwashydrolyzedwithAlcalaseproteaseforits
morecomprehensiveuse.Toestimatethehydrolysisefects, thedegreeofhydrolysis(DH)wereinvesti-
gated.Onthebasisofsinglefactortests, theoptimalhydrolysisconditionsweredeterminedbyorthogonal
experimentsbyinvestigatingtheDHandDPPHradical-scavengingactivity.Theresultsindicatedthat
theoptimalconditionsofpreparingtheapricotkernelproteinhydrolysateswithstrongantioxidantcapacity
wereasfolows:pH8.0 , temperature55℃, ratioofenzymeconcentrationtosubstrateconcentration
4%, substrateconcentration5%.Undersuchconditions, theDHwas21.02% andtheDPPHradical-
scavengingactivityofthehydrolysatewas66.13%.
Keywords:apricotkernelprotein;Alcalaseprotease;hydrolysis;antioxidativeactivity
　　近年来 , 由于化学抗氧化剂的不安全性 ,高
效 、低毒的天然食品抗氧化剂成为目前一大研究
热点 。同时 ,由于自由基生命科学的发展 ,具有抗
氧化作用的功能性食品和药物也引起了众多学者
的关注 [ 1] 。
大量研究证明 ,蛋白质经合适的蛋白酶水解制
成的多肽产品具有一定的抗氧化活性 [ 2] 。张君慧
等 [ 3]人研究了大米蛋白酶解产物的抗氧化活性 ,汪
兴平等 [ 4]人通过非脂质体系抗氧化试验研究了葛
仙米藻蓝蛋白的抗氧化能力 , Zhu等 [ 5] 人研究了小
麦胚芽蛋白 Alcalase水解物的清除自由基能力。此
外 ,还有报道利用玉米蛋白 、花生蛋白 、双低菜籽蛋
白 、鹰嘴豆蛋白 [ 6-9]等水解制备抗氧化肽的研究 。
杏仁是蔷薇科李属植物———杏 (Prunusarme-
niacaL.)的种子 ,脱苦 、脱甙的杏仁是一类优质的
植物蛋白资源 ,其氨基酸组成平衡合理 ,营养价值较
高[ 10] 。本文以杏仁蛋白粉为原料 ,用 Alcalase2.4L
蛋白酶对其进行水解 ,研究水解过程中水解度的变
化及水解条件对水解物抗氧化活性的影响 ,确定杏
仁蛋白酶解制备抗氧化肽的最佳工艺条件 ,以期为
深入开发利用杏仁蛋白资源及杏仁蛋白深加工提供
理论依据 ,为开发具有抗氧化活性的杏仁蛋白水解
产物提供理论支持 。
1　材料与方法
1.1　材料 、仪器
　　苦杏仁:陕西志丹产 ,购自西安市万寿路药材市
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　　2009 Vol.34 No.7
场;碱性蛋白酶 Alcalase2.4L:丹麦诺维信 (Novo)
公司;其他试剂均为国产分析纯 。
超速粉碎机 ,夹层玻璃反应器 ,紫外可见分光光
度计 , 501A型超级恒温水浴槽 , TGL-16G型高速
离心机 , LGJ-10型冷冻干燥机 , PHS-3C型精密
pH计 , SZ-93型自动双重纯水蒸馏器 。
1.2　试验方法
1.2.1　原料预处理 　杏仁用 0.3%盐酸溶液浸泡
2 d,脱苦 ,去毒。手工去皮后于 40℃烘箱干燥 ,粉
碎过 60目筛 ,室温下用石油醚 (30 ～ 60℃)脱脂 3
次 ,置通风橱中 12 h以挥发溶剂 ,得脱脂粉 ,于冰箱
4℃保存备用。
1.2.2　杏仁蛋白的提取 [ 10] 　取一定量脱脂杏仁粉
与水按 1∶13(m/V)混合 ,用 1mol/LNaOH调 pH至
11.0,于 45℃下磁力搅拌浸提 30 min,然后在 4℃
下以 4 000r/min离心 20min。沉淀物再重复提取 1
次 ,合并 2次上清液 ,用 1 mol/LHCl调 pH至等电
点(4.5)以沉淀蛋白质 ,经静置沉淀后 ,以双蒸水洗
涤沉淀 2次 ,醇洗 2次 ,再水洗 1次 ,后用 1 mol/L
NaOH回调 pH至 7.0 ,搅拌使沉淀复溶后 ,真空冷
冻干燥即为杏仁蛋白粉。
1.2.3　杏仁蛋白的酶解　取一定量杏仁蛋白粉
(粗蛋白含量 85%,以干基计),按一定底物浓度加
入双蒸水 ,在夹层玻璃反应器中搅拌 ,待温度恒定
后 ,调至一定的 pH,按一定的酶底比加入蛋白酶开
始水解 ,搅拌状态下不断加入 0.5 mol/LNaOH,使
反应体系的 pH始终维持在试验规定值范围内 ,水
解一定时间后 ,终止反应 ,沸水浴灭酶 15 min。冷却
后以 12 000 r/min离心 30min,取上清液冷冻干燥 ,
4℃贮藏备用。
1.2.4　水解度的测定　采用 pH-stat法 [ 11] 。水解
度的计算公式为:
水解度 =V×cb×(1 /α)×(1/MP)×(1/htot)×
100%
式中:V———碱液体积 , mL;
cb———碱液浓度 , mol/L;
α———α-氨基的解离度;
MP———底物中蛋白质含量 , g;
htot———底物蛋白质中的肽键总数 ,对杏仁蛋
白而言 , htot=7.58mmol/g。
1.2.5　最优酶解条件的确定　为了获得高活性的
杏仁抗氧化肽 ,在单因素试验基础上 ,以水解度和水
解物的 DPPH自由基清除能力为指标 ,通过 L9(34)
正交试验确定最佳酶解条件。各因素和水平的选取
见表 1。
表 1　正交试验因素水平
水平 因　素ApH B温度 /℃ C酶底比 /% D底物浓度 /%
1 8.0 50 2 3
2 8.5 55 3 4
3 9.0 60 4 5
1.2.6　杏仁蛋白水解物在 DPPH体系中抗氧化性
的测定[ 12] 　等量称取不同水解度的样品适量溶于
2mL去离子水中 , 加入 2 mLDPPH溶液 (0.1
mmol/LDPPH95%乙醇溶液),混匀后在室温下避
光反应 20 min, 10 000r/min离心 10min,在 517 nm
下测吸光值 Ai,空白组为 2 mL95%乙醇代替 DPPH
溶液 ,加入 2mL去离子水测定吸光值为 Aj,对照组
为 2mLDPPH溶液加上 2 mL去离子水代替样品在
517 nm下测定其吸光值 A0 ,并以等体积去离子水和
95%乙醇混合液空白调零 。平行测 3次 ,取平均值。
清除率按下式计算:
清除率 =[ 1-(Ai-Aj)/A0 ] ×100%
式中:A0———对照组吸光值;
Ai———样品组吸光值;
Aj———空白组吸光值 。
2　结果与分析
2.1　Alcalase蛋白酶水解杏仁蛋白的单因素试验
2.1.1　pH对水解度的影响(见图 1)　Alcalase碱
性蛋白酶的最佳 pH在 8.0左右 ,所以本文选择以
pH7.0 ～ 9.0的梯度进行试验。从图 1可以看出 ,
Alcalase蛋白酶在不同 pH条件下水解杏仁蛋白 ,水
解度均随时间的延长逐渐增加 ,并且 pH越大杏仁
蛋白的水解度也越大。 pH7.0与 pH9.0时的水解
度相差大约 20%,说明 pH对 Alcalase蛋白酶水解
杏仁蛋白的影响相当显著。当 pH为 9.0时水解度
最大 ,因此选择最适 pH为 9.0。
图 1　不同 pH条件的杏仁蛋白水解进程曲线
2.1.2　温度对水解度的影响(见图 2)　Alcalase蛋
白酶对底物的最适作用温度在 40 ～ 60℃,因此试验
选择 45、50、55℃和 60℃这 4个温度条件对杏仁蛋
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白进行水解。从图 2可以看出 , 50℃和 55℃时 Al-
calase蛋白酶水解杏仁蛋白的水解度差异明显 ,温
度因素影响显著 ,最佳水解温度为 60℃。
图 2　不同温度条件的杏仁蛋白水解进程曲线
2.1.3　底物浓度对水解度的影响(见图 3)　在温
度 50℃、pH8.0、酶用量 20 μL时 ,分别在底物浓度
为 2%、3%、4%和 5%的条件下进行水解 。从图 3
可以看出 ,随着底物浓度的增加 ,水解度不断增大 ,
底物浓度每增加 1%,水解度提高大约 5%。当底物
浓度为 5%时 ,水解度最高可达 28%左右 ,因此选择
最佳底物浓度为 5%。
图 3　不同底物浓度条件的杏仁蛋白水解进程曲线
2.1.4　酶底比对水解度的影响(见图 4)　在酶浓
度小于底物浓度时 ,一般认为酶反应速度正比于酶
浓度。本试验考察了不同酶底比对水解度的影响。
图 4　不同酶底比条件的杏仁蛋白水解进程曲线
　　由图 4可见 ,随着酶底比的增加 , Alcalase蛋白
酶水解杏仁蛋白的初速度加快 ,水解度增大 ,当酶底
比为 4%时 ,在本试验条件下最后水解度基本达到
最大值 ,再继续增大酶底比水解度无明显增长 ,因此
选择 4%为最佳酶底比 。
　　综合以上单因素试验结果 ,初步确定 Alcalase
蛋白酶的水解条件为:水解温度 60℃, pH9.0,底物
浓度 5%,酶底比 4%。在此水解条件下 ,测得杏仁
蛋白水解物的水解度为 29.28%, DPPH自由基清除
率为 24.02%。
2.2　杏仁蛋白酶解条件的优化
　　采用 Alcalase蛋白酶水解杏仁蛋白 ,以水解度
和清除 DPPH自由基的能力为指标 ,优化酶解条件 ,
正交试验方案及结果见表 2。
表 2　正交试验结果
试验号 A B C D 水解度/%
清除率
/%
1 1 1 1 1 11.71 49.77
2 1 2 2 2 20.17 58.98
3 1 3 3 3 21.88 63.65
4 2 1 2 3 18.99 53.82
5 2 2 3 1 21.24 65.75
6 2 3 1 2 22.78 50.85
7 3 1 3 2 25.07 33.02
8 3 2 1 3 23.67 41.73
9 3 3 2 1 29.13 24.48
水解度
k1 17.92 18.59 19.39 20.69
k2 21.00 21.69 22.76 22.67
k3 25.96 24.60 22.73 21.51
R 8.04 6.01 3.38 1.98
清除率
k1 57.47 45.54 47.45 46.67
k2 56.81 55.49 45.76 47.62
k
3 33.08 46.33 54.14 53.07
R 24.39 9.95 8.38 6.40
　　由表 2可知 ,影响杏仁蛋白水解物水解度的各
因素排列顺序为 pH>温度 >酶底比 >底物浓度 ,最
佳酶解条件为 A3B3C2D2 , 即 pH为 9.0、温度为
60℃、酶底比为 3%、底物浓度为 4%;而影响杏仁蛋
白水解物对 DPPH自由基清除率的各因素排列顺序
为 pH>温度 >酶底比 >底物浓度 ,最佳酶解条件为
A1B2C3D3 ,即 pH为 8.0、温度为 55℃、酶底比为
4%、底物浓度为 5%。试验结果表明 , 水解物的
DPPH自由基清除率并不随着水解度的增加而增大 ,
二者之间并不存在线性相关 ,只有在特定的水解度
下 ,清除能力最强 ,超过或者低于这个水解度 ,清除
能力均下降。考虑到本试验为制备抗氧化能力较强
的杏仁蛋白水解物 ,因此选择最佳酶解条件为:pH
8.0,温度 55℃,酶底比 4%,底物浓度 5%。在此条
件下进行验证试验 ,测得水解度为 21.02%, DPPH
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　　2009 Vol.34 No.7
自由基清除率为 66.13%,高于鹰嘴豆蛋白水解物
的 DPPH自由基清除率(59.11%)[ 9] 。
3　结　论
　　利用 Alcalase蛋白酶水解杏仁蛋白 ,通过单因
素试验和正交试验 ,表明体系的 pH对水解过程有
较大影响 ,水解产物的 DPPH自由基清除率与水解
度的大小不存在线性相关。为得到具有较强 DPPH
自由基清除能力的水解物 , Alcalase蛋白酶水解杏
仁蛋白的最佳条件为:pH8.0 ,温度 55℃,酶底比
4%,底物浓度 5%。在此条件下进行水解试验 ,水
解度为 21.02%,水解物对 DPPH自由基的清除率
为 66.13%。
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