全 文 ： 
浆水中细菌多样性分析及乳酸菌的分离鉴定
张晓辉，杨靖鹏，王少军，王 静，樊明涛，魏新元*
（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

摘 要：分析了从三个不同地方采集的浆水中的细菌多样性，分离和鉴定了浆水中对常见食源性致病菌抑菌效果好的优
势乳酸菌。提取浆水总 DNA，采用 MiSeq技术对细菌 16S rRNA的 V3-V4区进行测序分析，获得浆水中的细菌的多样
性。结果显示乳杆菌在三种浆水中为优势菌，三种浆水中的细菌多样性存在差异，TS_taian 和 XA_changan 两种浆水中
的细菌多样性组成比较相近，而 XA_yanta 则与前面两种浆水差异性比较大，在三种浆水中检测到致腐菌和可能的致病
菌（或条件致病菌），这无疑增加了对浆水安全性的担忧。利用改良的MRS培养基从 3种浆水中分离获得 35株产生溶
钙圈的菌株，挑选其中 10 株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和痢疾志贺氏菌四种常见食源性致病菌抑制
效果好的菌株进行 16S rRNA测序鉴定，其中 8株为植物乳杆菌，2株为鼠李糖乳杆菌，说明该两种菌在浆水中为优势
菌，该两种菌当前普遍认为是安全的，这为今后可以利用此两株菌进行单菌发酵或混合发酵生产浆水提供一定的理论和
实践的依据。
关键词：浆水；细菌多样性；乳酸菌
The bacterial diversity analysis and the isolation and identification of lactic acid bacteria in Jiangshui
ZHANG Xiaohui, YANG Jingpeng, WANG Shaojun, WANG Jing, FAN Mingtao, WEI Xinyuan*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100 )
Abstract: In this study, the bacterial diversities were analysed in three Jiangshui sammples collected from three different local.
The lactic acid bacteria which had good inhibition effect on 4 kinds of common foodborne pathogens were isolated and identified.
The total DNA was extracted from different Jiangshui and then the bacteria diversity were obtained via MiSeq technology with
sequencing and analysis of V3-V4 regions in 16S rRNA. The results showed that lactobacillus were dominant in three Jiangshui
samples and their bacterial diversities were different. The diversities were similar between TS_taian and XA_changan, but both
were much different from XA_yanta which bacteria diversity was much more. Spoilage bacteria and pathogenic bacteria (or
conditional pathogenic bacteria) were detected in three Jiangshui, so it increased the worry about the safety of Jiangshui. 35
stains which could form soluble Cacium circle were isolated through modified MRS medium. 10 strains with outstanding
inhibition activity to Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis and Shigella dysenteriae were selected out
and identified through 16S rDNA sequencing. There were 8 strains of Lactobacillus plantarum and 2 strain of Lactobacillus
rhamnosus. It means that Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus were dominant. The two species of lactic acid
bacteria is generally recognized as safe at present. The study provided some theory and practice basis for the future manufacture
of Jiangshui by apply one or both of the two species of lactic acid bacteria.
Keywords: Jiangshui; Bacterial diversity; Lactic acid bacteria
中图分类号：Q935 文献标志码：A 文章编号：
                                                              
收稿日期：
基金项目：公益性行业(农业)科研专项(201503142-10)；陕西省农业科技创新与攻关项目(2016NY-148)；西北农林科技大
学基本科研业务费专项(QN2011138)
作者简介：张晓辉（1993-），本科生，研究方向为食品安全与食品高新技术。E-mail：zhangxiaohui9641@163.com
*通讯作者：魏新元（1971-），副教授，研究方向为食品安全与食品高新技术。E-mail：wheixinyuan@126.com
2016-06-22
1
网络出版时间：2016-06-23 16:18:57
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20160623.1618.110.html
 
浆水是一种传统发酵食品，其味酸醇，清香，爽口。在我国北方地区食用历史悠久，多被用于夏季制汤或下
面，具有很强的保健功效。近年来，南方一些地区的人们也开始制作浆水菜，并用酸浆水点制豆腐，制成的豆腐
微酸，鲜嫩，口感好，没有异味，深受人们的喜爱[1]。
浆水的传统制作过程是将时令绿色蔬菜焯水后，加入制备好的面汤或米汤装入缸或罐中，再加入用老浆水作
的引子，并在缸口或罐口加盖纱布，借助于蔬菜表面和原始浆水中的有益微生物，利用蔬菜原料初加工处理时流
出的汁液，让其自然发酵，最终获得成品[2]。其发酵过程一般经过 3个阶段，即初期、中期和后期。每个阶段的微
生物区系都很复杂，但乳酸菌为其中主要的发酵菌群[3]。近年来不少学者研究发现乳酸菌不仅可以调节机体胃肠道
菌群稳定[4]、保持胃肠道微生态平衡，提高食物消化率[5]，而且还可以降低人体肠道内胆固醇[6-7]，抑制肠道内致病
菌生长繁殖[5]，制造营养物质，促进机体吸收利用，从而调节机体的营养状态和生理功能，作用于细胞感染、药物
效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生和应急反应等过程[8-10]，对人体有很强的益生作用。
浆水自然发酵周期长，发酵过程受很多因素影响，不同的蔬菜及老浆水中微生物菌群复杂，在浆水中极有可
能存在腐败菌甚至致病菌污染的情况[11-12]。因此，本研究拟对浆水中的细菌多样性进行分析，揭示浆水中的优势
菌及可能存在的腐败菌或致病菌；然后对浆水中的乳酸菌进行分离鉴定，获得浆水中的优势菌种并鉴定，为今后
浆水的纯种发酵以及工业化生产质量稳定、健康安全的浆水产品提供基本理论和实践依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验样品
试验所用的三种浆水样品皆以芹菜为材料，分别采自不同地方。
样品 1：陕西省西安市雁塔区大寨路与丈八北路十字新乐城小区，编号为 XA_yanta（XA 是西安市首字母，
yanta是指雁塔区）。
样品 2：陕西省西安市长安区韦曲街道西韦村二组 64 号，编号为 XA_changan（XA 是西安首字母，changan
是指长安区）。
样品 3：甘肃省天水市泰安县西川工业园区天水新世纪工贸有限公司，编号为 TS_taian（TS是天水市首字母，
taian是指泰安县）。
1.1.2 主要试剂
溶菌酶、蛋白酶 K、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液、氯仿/异戊醇(24:1)混合液均购自北京索莱宝科技有限公
司；琼脂糖购自美国 Invitrigen公司；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；1M Tris-HCl溶液（pH8.0），0.5M
EDTA溶液（pH8.0），10×TE Buffer（pH8.0），10%SDS溶液，5M NaCL溶液等均按照宝生物工程(大连)有限公
司提供的说明书配制。
1.1.3 培养基
MRS琼脂培养基：每 1000ml培养基中含有蛋白胨 12 g，牛肉膏 10 g，酵母浸膏 5 g，无水醋酸钠 5 g，吐温
-80 1 ml，磷酸氢二钾 2 g，七水硫酸镁 0.5 g，四水硫酸锰 0.25 g，柠檬酸二铵 2 g，葡萄糖 20 g，琼脂 14-18 g，
pH7.0-7.2[13]。
改良MRS琼脂培养基：在MRS培养基中添加含 0.75% CaCO3，pH7.0-7.2[13]。
LB培养基：每 1000ml培养基中含有蛋白胨 10g，酵母浸粉 5g，氯化钠 10g，pH 7.0-7.2。
1.2 试验方法
1.2.1 样品采集
2016-06-22
2
 
使用无菌密封袋采集浆水样品，置于低温保温容器中带回实验室，振荡后静置 3 分钟，将上清分装入 50ml
无菌离心管中，每个样品留下 1管进行乳酸菌分离，其余样品离心收集沉淀备用。
1.2.2 浆水中细菌多样性分析
1.2.2.1 浆水中微生物基因组 DNA提取
浆水中微生物基因组 DNA提取采用 CTAB法[14]：将 1.2.1中于贮存备用的浆水沉淀采用 CTAB法进行基因组
DNA 的提取，提取的 DNA 经 0.7%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用紫外分光光度计测定 OD260进行定量，并考查
OD260/OD280。
1.2.2.2 浆水中细菌多样性分析
浆水中细菌多样性分析采用 MiSeq 技术：委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。向该公司提供 1.2.2.1
提取的足量的基因组 DNA，由公司测序后提供数据[15-18]。
1.2.3 浆水中乳酸菌的分离、纯化与初步筛选
1.2.3.1 浆水中乳酸菌的分离
乳酸菌的分离采样稀释平板法[19]：取 1mL浆水菌悬液，置于 9 mL灭菌生理盐水中，混匀后从中取 1mL加入
另一只 9 mL灭菌生理盐水中，以此类推，将浆水稀释至原液的 10-9。然后，取各稀释度菌悬液各 1mL分别注入
无菌培养皿中，接着向培养皿中加入融化并 50℃保温的改良 MRS 琼脂培养基，在培养皿中将培养基与菌悬液快
速混匀，静置，待培养基凝固后，37℃培养箱中培养 36-48h。
1.2.3.2 浆水中乳酸菌的纯化与初步鉴定
乳酸菌的纯化采样划线分离法[19]：选取在上述改良MRS琼脂培养基中生长并产溶钙圈的单菌落，在改良MRS
固体培养基的平皿中进行划线分离，37℃培养 48h 后。从中选取产溶钙圈的单菌落。然后对疑似菌株进行革兰氏
染色，选取革兰氏染色阳性，菌株形态单一的进行进一步鉴定。
1.2.4 疑似乳酸菌对肠道致病菌的抑制作用
疑似乳酸菌的抑菌作用采用牛津杯法[20]：以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和痢疾志贺氏菌四种
食源性致病菌为指示菌，将培养好的致病菌菌悬液加入无菌培养皿中，随后向平皿中注入 20 mL左右的溶化后 50℃
水浴保温的 LB 固体培养基，摇动混匀，静置凝固后将无菌牛津杯放于培养基表面，使其与培养基无缝接触，然
后将乳酸菌发酵培养物滤液注入牛津杯中，平皿放入 37℃培养箱中培养 24-48 h，测量抑菌圈直径大小。每组试验
做四个重复一个对照。
1.2.5 疑似乳酸菌的鉴定
1.2.5.1 乳酸菌的 DNA提取
菌株 DNA的提取采用 CTAB法[21]：将待鉴定菌株在液体 MRS培养基中培养 48小时后收集菌体，然后采用
CTAB 法对疑似乳酸菌基因组 DNA进行抽提与纯化，提取的 DNA 通过 0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测，DNA溶液
置于-20℃冰箱中保存备用。
1.2.5.2 乳酸菌的 16S rDNA的 PCR扩增与测序
16SrDNA序列获得采用 PCR扩增[21]：以乳酸菌基因组 DNA为模板，采用通用引物
27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 和 1495r (5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA)，进行乳酸菌 16S rDNA的 PCR
扩增[22]。PCR扩增程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性 45 sec，56℃退火 45 sec，72℃延伸 1.5 min，35 个循环；
72 ℃延伸 10min。PCR结束后，以 1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。对于电泳结果显示条带大小与理论值相符者，
用凝胶回收试剂盒进行回收，然后送至上海立菲生物技术有限公司(北京)测序。
1.2.5.3 乳酸菌的 16S rDNA序列分析与菌株鉴定
2016-06-22
3
 
16S rDNA序列分析采用在线 Blastn法：将双向测序并拼接得到的 16S rDNA序列在 NCBI数据库中采用 blastn
比对，进行同源性分析鉴定。

2 结果与分析
2.1 浆水中细菌多样性分析
2.1.1 浆水中 DNA提取预定量
采用 CTAB法提取三种不同来源浆水中总 DNA，期间加入无 DNA酶的 RNA酶处理纯化，最后所得的 DNA
测其 OD值，其中 XA_yanta为 104.50 ng/μL，XA_changan为 204.11ng/μL，TS_taian为 71.59 ng/μL，琼脂糖凝胶
电泳显示 RNA处理效果比较理想（数据未展示），且 OD260/OD280均介于 1.8-2.0之间，因此按照上海美吉生物医
药科技有限公司要求提供足量的 DNA，委托上该公司进行测序，分析浆水中的细菌多样性。
2.1.2 浆水中细菌多样性分析
2.1.2.1 Shannon-Wiener曲线
Shannon-Wiener 是反映样本中微生物多样性的指数，利用各样本的测序量在不同测序深度时的微生物多样性
指数构建曲线，反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性[23]。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，
可以反映样本中绝大多数的微生物信息。本次细菌多样性分析的测序深度曲线见图 1，图 1 显示，各样品的微生
物多样性指数很快便达到一定数值，并不再随测序量增大而增大，曲线趋向平坦，故说明测序数据量足够大，可
以反映样本中绝大多数的微生物信息。

图 1 Shannon-Wiener曲线
Fig.1 The Shannon-Wiener curve
2.1.2.2 OTU聚类分析与不同样品间细菌多样性比较
Venn图可用于统计多个样本中所共有和独有的 OTU数目，可以比较直观的表现样本的 OTU数目组成相似性
及重叠情况[24]。通常情况下，分析时选用相似水平为 97%的 OTU 样本表,按照 97%相似性对非重复序列（不含单
序列）进行 OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，共得到 OTU的代表序列 43个（数据未展示）。并通过作 Venn
图来比较样品间细菌多样性的异同，如图 2。由图可以看出三个样品之间既有共存细菌，也有独自存在的细菌。

图 2 OTU 比较 venn图
Fig.2 Comparison Venn chart among OTU of three samples
2016-06-22
4
 
2.1.2.3 细菌群落结构分析
采用 RDP classifier贝叶斯算法对 97%相似水平的 OTU代表序列进行分类学分析，并在种属水平统计了每个
样品的群落组成（图 3、图 4）。
图 3 各样品的菌种分布扇形图
Fig.3 The strain distribution circle graph of the three samples
图 4 样品菌种分布柱状图
Fig.4 The strain distribution bar graph of the three samples
由图 3和图 4可以看出三种浆水中主要菌群为乳杆菌（Lactobacillus），尤其是浆水XA_changan和浆水 TS_taian
中乳杆菌（Lactobacillus）达到 98%以上，两种浆水在细菌多样性组成上比较接近，浆水 XA_yanta 中乳杆菌
（Lactobacillus）也达到 70%以上。此外，浆水 XA_changan中还存在极少量的醋酸杆菌（Acetobacter，0.04%）和
链球菌（Streptococcus，0.03%）；浆水 TS_taian中还存在少量醋酸杆菌（Acetobacter，1.07%）和魏斯氏菌（Weissella，
0.01%）；而浆水 XA_yanta 还含有 14.71%的魏斯氏菌（Weissella）、5.70%的链球菌（Streptococcus）、4.94%的
乳球菌（Lactococcus）及 4.43%的其他细菌。
从图 4还可以看出，通过比较分析，来自西安长安区和来自天水泰安的浆水细菌多样性比较相似，而且多样
性很简单，但是西安雁塔区的浆水与它们相比，多样性存在较大差异，而且西安雁塔区浆水中的细菌多样性比较
复杂。
2.1.2.4 浆水样品中群落结构多样性分析
为了检测不同浆水细菌多样性种类的异同，不同样品中的细菌多样性信息被详细分析，作出群落结构Heatmap，
如图 5，图中不同颜色代表菌种 OTU 数目占总体 OTU 数目的百分比，纵轴显示菌种的种类，该图更清晰的展示
了三种浆水样品中的细菌组成。
2016-06-22
5
 
图 5 常规群落结构 Heatmap图
Fig.5 The Heatmap of strains formation in three samples
图 5显示，TS_taian浆水中的有乳杆菌属、醋酸杆菌属、嗜热菌属及假单胞菌属等。XA_changan浆水中有乳
杆菌属、链球菌属、克雷伯氏菌属、索氏菌属、假单胞菌及不动杆菌属等。而 XA_yanta浆水细菌多样性最丰富，
有乳杆菌属、魏斯氏菌属、链球菌属、乳球菌属、微小杆菌属、克雷伯氏菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、梭状
芽孢杆菌、明串珠菌属、固氮菌、月形单胞菌属、拟杆菌属、库特氏菌属及醋酸杆菌属等。
2.2 乳酸菌的分离与纯化
将梯度稀释的浆水菌悬液采用倾注法进行分离后，选取在改良MRS培养基产生溶钙圈的单菌落进一步在改良
MRS进行划线分离，优先选择稀释度高和菌落形态有差异的。然后，将划线分离后依然产生溶钙圈的单菌落进行
斜面划线培养后保藏，共得到 35株疑似乳酸菌。同时进行革兰氏染色，染色结果显示菌体均呈革兰氏染色阳性，
且菌体形态单一，菌株之一WZS_013的显微图像如图 6。

图 6 菌株WZS_013的革兰氏染色 （放大倍数：1000）
Fig.6 The shape of strain WZS_013 under microscope after Gram stain (Magnification times: 10*100)
2.3 疑似乳酸菌对肠道致病菌的抑制作用
通过牛津杯法测定 35株疑似乳酸菌对四种食源性致病菌的抑制圈大小，所得结果如表 1所示。
2016-06-22
6
 
表 1 疑似乳酸菌对食源性致病菌的抑制作用
Table 1 The inhibition of possible lactic acid bacteria on foodborne pathogens
乳酸菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 肠炎沙门氏菌 痢疾志贺氏菌
WZS_001 4.70 4.23 6.33 5.73
WZS_002 5.17 4.10 5.17 4.50
WZS_003 6.50 4.70 5.10 4.50
WZS_004 4.33 3.27 4.63 4.97
WZS_005 4.77 3.33 5.23 7.73
WZS_006 2.67 2.53 5.17 5.60
WZS_007 7.13 3.67 7.60 6.10
WZS_008 3.67 3.17 6.27 5.13
WZS_009 4.35 2.35 1.95 2.40
WZS_010 2.45 2.20 3.04 1.95
WZS_011 2.35 2.30 5.90 2.50
WZS_012 7.33 2.10 6.22 7.18
WZS_013 7.20 7.40 7.50 5.90
WZS_014 0.87 1.50 6.50 3.40
WZS_015 1.70 2.00 5.65 2.10
WZS_016 1.80 1.60 3.20 5.55
WZS_017 1.95 1.90 3.08 2.80
WZS_018 4.05 2.15 3.79 3.35
WZS_019 2.30 2.55 4.48 2.90
WZS_020 2.25 1.95 3.76 2.95
WZS_021 1.20 1.90 1.96 1.95
WZS_022 2.95 2.45 2.40 2.55
WZS_023 2.70 3.75 6.45 4.45
WZS_024 1.75 1.95 1.90 3.25
WZS_025 3.30 5.10 7.21 6.97
WZS_026 7.50 3.05 7.00 4.60
WZS_027 2.95 2.00 5.30 2.10
WZS_028 2.95 1.70 4.45 3.70
WZS_029 4.70 2.10 7.00 6.15
WZS_030 2.95 1.95 2.00 1.95
WZS_031 2.65 1.90 3.95 1.80
WZS_032 1.98 2.67 5.83 4.93
WZS_033 2.53 2.35 7.60 2.85
WZS_034 6.15 2.85 6.50 5.20
WZS_035 3.70 3.05 6.80 4.50
对数据进行整理分析后发现菌株WZS_001，WZS_002，WZS_003，WZS_005，WZS_007，WZS_012，WZS_013，
WZS_025，WZS_026，WZS_029十株对四种致病菌抑制能力较强，因此，挑选出来对其进行菌种鉴定。
2.4 疑似乳酸菌 16S rDNA的 PCR扩增及菌种鉴定
2.4.1 疑似乳酸菌基因组 DNA提取
2016-06-22
7
 
采用 CTAB法提取的上述十株疑似乳酸菌的基因组 DNA经琼脂糖凝胶电泳如图 7所示，由图可以看出 DNA
条带单一，大小比较理想，质量较好，可以作为模板用于 PCR扩增反应。
图 7 8株疑似乳酸菌基因组 DNA琼脂糖凝胶电泳
泳道M：λ DNA Marker（Hind Ⅲ），泳道 1-8：分别为菌株WZS-001、WZS-002、WZS-003、WZS-005、WZS-007、WZS-012、WZS-013和WZS-025
Fig.7 The agarose gel electrophoresis of genome DNA of 8 strains possible lactic acid bacteria
Lane M: λ DNA Marker (Hind ), Lane 1Ⅲ -8: Strain WZS-001、WZS-002、WZS-003、WZS-005、WZS-007、WZS-012、WZS-013 and WZS-025,
respectively.
2.4.2 疑似乳酸菌 16S rDNA的 PCR扩增
以 CTAB法提取的基因组 DNA为模板，利用扩增细菌 16S rDNA的通用引物 27f和 1495r进行 16S rDNA的
PCR扩增，电泳结果如图 8。由图可以看出，PCR扩增片段大小约在 1500bp位置，与理论值接近。然后，利用凝
胶回收试剂盒进行回收后送上海立菲生物技术有限公司(北京)测序。

图 8 8株疑似乳酸菌 16S rDNA基因 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
泳道M：100 bp DNA Ladder，泳道 1-8：分别为菌株WZS-001、WZS-002、WZS-003、WZS-005、WZS-007、WZS-012、WZS-013和WZS-025。
Fig.8 The agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products of 8 strains possible lactic acid bacteria
Lane M: 100 bp DNA Ladder, Lane 1-8: Strain WZS-001、WZS-002、WZS-003、WZS-005、WZS-007、WZS-012、WZS-013 and WZS-025, respectively.
2.4.3 疑似乳酸菌的 16S rDNA序列比较分析与鉴定
将疑似乳酸菌的 16S rDNA测序所得序列（数据未展示）在 NCBI网站进行在线 blastn比对，比对结果显示菌
株WZS_001，WZS_002，WZS_003，WZS_005，WZS_007，WZS_025，WZS_026，WZS_029八株菌与植物乳杆
菌WCFS1相似度达 100%，因此该八株菌被鉴定为植物乳杆菌；菌株WZS-012和WZS-013与鼠李糖乳杆菌有大
于 94%的相似水平，因此该二株菌被鉴定为鼠李糖乳杆菌。

3 结论与讨论
目前浆水深受广大人民群众喜爱，一方面因为其特有的风味，另一方面因为浆水中含有对人体健康有益的益
生乳酸菌。当前的对浆水的研究依然能主要集中在发酵制作工艺[25]与对其中益生菌乳酸菌分离、筛选及功能性研
究方面[26-29]，乳酸菌新的功能及代谢活性被继续挖掘，如降胆固醇[26]，γ-氨基丁酸[28]，降亚硝酸[29]等。但是，对
于浆水中微生物的复杂性的分析及安全性的评价尚少。
对于浆水中细菌多样性的测定，本研究通过测定细菌 16S rDNA的可变区的核苷酸序列，然后比较分析获得，
2016-06-22
8
 
结果显示，浆水中的细菌以乳杆菌为主，这与其他学者的研究结果相符[27, 29]，但是不同的采集地的浆水中的细菌
多样性并不一致。由图 3、4、5可以看出，TS_taian浆水和 XA_changan浆水中有乳杆菌占了绝大多数（98%以上），
其他杂菌无论是种类还是所占比例均非常小；XA_yanta浆水相对前两种浆水来说，乳杆菌所占比例较低，尽管依
然占了其中的大部分（70.22%）。而且除了乳杆菌，其他菌在种类上也存在较大差异，TS_taian 浆水（含乳杆菌
和醋酸杆菌）和 XA_changan（含乳杆菌和魏斯氏菌）除了两类尚无有害报道的细菌外，都含有一种可能的致病菌
（或者条件致病菌）或者其他暂时无法确定是否有害的菌；而 XA_yanta浆水中除了含有的乳杆菌和魏斯氏菌，其
他的可能致病菌较前两种浆水种类更多，在菌数上所占比例也较大，这是否可能浆水所处的发酵时期不一样，
XA_yanta浆水的发酵时间较另外两种要短。尽管三种浆水中乳酸菌都占了绝大多数，但是由于其他腐败菌及致病
菌（或条件致病菌）的存在，如克雷伯氏菌属、不动杆菌属、气单胞菌属等。李雪萍等[11-12, 27]的研究也发现浆水
中还存在霉菌和肠道菌等有害菌的污染，不利于浆水的发酵和保存，对食品的安全性也存在风险，因此很有必要
对浆水进行标准化、规范化生产。
对乳酸菌的分离，本研究通过半选择性的改良MRS培养基进行初步筛选，这样，具有产酸能力并且酸性强于
碳酸的就会溶解培养基中的碳酸钙而形成溶钙圈，然后对其进行抑菌实验，筛选出抑菌能力强的菌株进行测序鉴
定。由于乳酸菌分离采用梯度稀释法从高稀释度中选出，抑菌效果佳，而且测序比对结果显示，筛选出的菌均为
植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，为浆水优势菌，该两种菌当前公认为安全的，因此可以用于浆水及相关食品的发酵
生产。
本研究中对浆水中细菌多样性的检测是针对 16S rDNA的 V3-V4区域进行扩增后测序得到，采用的是二代测
序技术，因此，能对细菌多样性的分析尚未鉴定到种，随着测序技术的发展，测序精度和深度不断进步，对序列
分析的软件也将不断地发展，这必将会大大地推动对不同样品中微生物多样性分析的深度和广度。
本研究从浆水中细菌的多样性方面揭示了浆水样品中存在着不同类群的细菌，尽管传统的自然发酵食品已经
盛行了很久，并且由于发酵过程中参与的微生物比较多，会增加一些特异性的风味，但是由于自然发酵食品不可
避免的可能被污染。基于食品安全的考虑，自然发酵食品在食用前应尽量进行安全性的检测与评估，或者选用已
知的益生乳酸菌纯种发酵或多种混合发酵进行浆水生产将会大大减少食品安全风险，也必将成为一种发展趋势。
因此，今后的研究方向将分别考察不同的乳酸菌在浆水发酵中的风味的影响，筛选出合适的乳酸菌进行纯种发酵
或混合菌发酵。

参考文献
[1] 管有根. 酸浆水点浆工艺生产塘坞豆制品[J]. 中国酿造. 2007, 5: 69-70. doi:10.3969/j.issn.0254-5071.2007.05.019.
[2] 侯智勇, 杨静, 贾洪锋, 等. 传统发酵食品——浆水菜研究概况及研究前景[J]. 中国调味品. 2015, 2: 132-136.
doi:10.3969/j.issn.1000‐9973.2015.02.031. 
[3] 孟宪刚, 张丽珂, 周鸽鸽, 等.传统发酵食品-浆水研究概况及发展前景展望[J]. 食品工业科技. 2010, 31(10): 402-404.
doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2010.10.084.
[4] 张基亮 , 何欣 , 李元敬 , 等 .细菌纤维素减肥功能测定及其酸奶的制作 [J].食品科学 . 2013, 34(12): 61-66.
doi:10.7506/spkx1002-6630-201312013.
[5] 赵树欣. 应重视对我国传统发酵食品的研究－兼论发酵食品中的功能成分[J]. 中国食物与营养. 2004, 1: 27-29.
doi:10.3969/j.issn.1006-9577.2004.01.010.
[6] JEUN J, KIM S, CHO SY, et al. Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus plantarum KCT3928 by increased bile acid
2016-06-22
9
 excretion in C57BL/6 mice[J]. Nutrition. 2009, 26 (3): 321-330. doi:10.1016/j.nut.2009.04.011.
[7] WANG Y, XU N, XI A, et al. Effects of Lactobacillus plantarum MA2 isolated from Tibet kefir on lipid metabolism and
intestinal microflora of rats fed on high-vholesterol diet[J]. Applied Microbiology and Biotechnology. 2009, 84(2): 341-347.
doi:10.1007/s00253-009-2012-x.
[8] LEROY F, De VUYST L. Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry[J]. Food
Science and Technology. 2004, 15(2) : 67-78. doi:10.1016/j.tifs.2003.09.004.
[9] MOLLET B. Genetically improved starter strains: opportunities for the dairy industry[J]. International Dairy Journal. 1999,
9(1) :11-15. doi:10.1016/S0958-6946(99)00039-4.
[10] CHAMPAGEN PP, TOMPKINS TA, BUCKLEY ND, et al. Effect of fermentation by pure and mixed cultures of
Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus on isoflavone and B-vitamin content of a fermented soy beverage[J].
Food Microbiology. 2010, 27( 7) :962-972. doi:10.1016/j.fm.2010.06.003.
[11] 张轶, 王玉丽, 陈晓前, 等. 传统发酵食品—浆水中微生物的分离与初步鉴定[J]. 食品科学. 2007, 28(1): 219-222. doi:
10.3321/j.issn:1002-6630.2007.01.052.
[12] 李雪萍, 李建宏, 孟宪刚. 西北浆水中兼性厌氧菌的分离与鉴定[J].食品工业科技. 2014, 35(12): 213-217. doi:
10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.038.
[13] ZHOU N, ZHANG JX, FAN MT, et al. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Chinese yogurts[J]. Journal
of Dairy Science. 2012, 95:4775-4783. doi:10.3168/jds.2011-5271.
[14] 刘冬梅 , 李理 , 杨晓泉 , 等 . 用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力 [J].食品研究与开发 . 2006, 27(3): 110-111.
doi:10.3969/j.issn.1005-6521.2006.03.044.
[15] FADROSH DW, MA B, GAJER P, et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing
on the Illumina MiSeq platform[J]. Microbiome. 2014, 2: 6-12. doi: 10.1186/2049-2618-2-6.
[16] SHAUFI MAM, SIEO CC, CHONG CW, et al. Deciphering chicken gut microbial dynamics based on high-throughput 16S
rRNA metagenomics analyses[J]. Gut Pathogens. 2015, 7: 4-15. doi:10.1186/s13099-015-0051-7.
[17] CAPORASO JG, LAUBER CL, WALTERS WA, et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the illumina
HiSeq and MiSeq platforms[J]. The International Society for Microbial Ecology Journal. 2012, 6: 1621-1624.
doi:10.1038/ismej.2012.8.
[18] KOZICH JJ, WESTCOTT SL, BAXTER NT, et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline
for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq illumina sequencing platform[J]. Applied and Environmental Microbiology.
2013, 79: 5112-5120. doi: 10.1128/AEM.01043-13.
[19] 张小美, 楼秀玉, 顾青. 1 株产细菌素乳酸菌的鉴定和细菌素的分离纯化[J]. 中国食品学报.2013, 13(12): 181-186.
doi: 10.16429/j.1009-7848.2013.12.039.
[20] 周 延 清 . DNA 分 子 标 记 技 术 在 植 物 研 究 中 的 应 用 [M]. 北 京 , 化 学 工 业 出 版 社 . 2005, 9-34.
doi:10.3969/j.issn.1004-3268.2008.06.004.
[21] 李睿 , 沈汪洋 , 翟平平等 . 观音土曲乳酸菌的分离与分子鉴定 [J].安徽农业科学 . 2011, 39(4): 1891-1892.
doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2011.04.001.
[22] 曲丰发, 蔡畅, 郑献进, 等. 16S rDNA建立种特异性 PCR快速检测鸭疫里默氏菌[J].微生物学报. 2006, 46(1): 13-17.
doi:10.3321/j.issn:0001-6209.2006.01.004.
[23] WANG Y, SHENG HF, HY, et al. Comparison of the levels of bacterial diversity in freshwater, intertidal wetland, and
marine sediments by using Millions of illumina tags[J]. Applied and Environmental Microbiology. 2012, 78(23): 8264-8271. doi:
10.1128/AEM.01821-12.
[24] FOUTS DE, SZPAKOWSKI S, PURUSHE J, et al. Next generation sequencing to define prokaryotic and fungal diversity in
the bovine rumen[J]. PLoS ONE. 2012, 7(11): 1-11. doi:10.1371/journal.pone.0048289.
[25] 侯智勇, 黄文刚, 孙晋康, 等. 川北地区浆水菜传统发酵工艺的初步研究[J]. 中国调味品. 2015, 40(7): 100-103.
doi:10.3969/j.issn.1000-9973.2015.07.022.
2016-06-22
10
 [26] 李雪萍, 李建宏, 李敏权, 等. 浆水中降胆固醇乳酸菌的筛选及其功能特性[J]. 微生物学报. 2015, 55(8): 1001-1009.
doi:10.13343/j.cnki.wsxb.20140585.
[27] 李雪萍 , 李建宏 , 孟宪刚 , 等 . 浆水中微生物的分离与鉴定 [J]. 食品科学 . 2014, 35(23): 204-209.
doi:10.7506/spkx1002-6630-201423040.
[28] 刘佳荣 , 梁金钟 . 黄浆水中高产 γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及鉴定 [J].. 食品科学 2014, 35(23): 221-225.
doi:10.7506/spkx1002-6630-201423043.
[29] 孟宪刚 , 李雪萍 , 李建宏 , 等 . 浆水中乳酸菌分离鉴定及其代谢特性的初步研究 [J]. 食品工业科技 . 2015,
36(1):181-187. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.029.

2016-06-22
11