全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (9) : 1311 - 1316
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009204215; 修回日期 : 2009208211
基金项目 : 国家自然科学基金项目﹙ 30370978﹚3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hukailin@ scau1edu1cn)
辣椒胞质雄性不育系与保持系蕾期基因表达差异分析
吴智明 1, 2 , 胡开林 23 , 乔爱民 1
(1仲恺农业工程学院农业与园林学院 , 广州 510225; 2 华南农业大学园艺学院 , 广州 510642)
摘 　要 : 利用 cDNA2AFLP差显技术比较分析了辣椒细胞质雄性不育系及其保持系蕾期基因的表达差
异 , 获得了 19条阳性差异转录片段 , 其中在不育系花蕾中特异表达的有 4条 , 在保持系花蕾中特异表达的
有 15条。通过对 19条差异片段进行序列同源性分析与功能分类 , 结果表明 : 在不育系花蕾中特异表达的
其中 3条与番茄和烟草线粒体、核糖体代谢相关基因有很高的相似性 ; 在保持系花蕾中特异表达的 12条能
找到与其相似性较高的序列 , 这些差异片段代表的基因涉及转录调控、防卫和胁迫反应、电子传递和能量
途径、DNA或 RNA代谢、蛋白质代谢、转运通道、未知或假定蛋白等。推测辣椒细胞质雄性不育的发生
可能受到多种代谢途径的共同调控。
关键词 : 辣椒 ; 细胞质雄性不育 ; 基因表达 ; cDNA2AFLP
中图分类号 : S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0921311206
D ifferen tia l Expression Ana lysis in Flower Buds of CM S and Its M a in ta iner
L ine of C apsicum annuum L.
WU Zhi2m ing1, 2 , HU Kai2lin23 , and Q IAO A i2m in1
(1 College of A gricu lture and L andscape A rchitecture, Zhongka i U niversity of A gricu ltural and Engineering, Guangzhou 510225,
Ch ina; 2 College of Horticu lture, Sou th China A gricu ltura l U niversity, Guangzhou 510642, China)
Abstract: In order to understand the mechanism of CMS in hot pepper, the gene exp ression in flower
buds of CMS line and its maintainer line was compared by means of cDNA2AFLP. A total of 19 differential
transcrip t2derived fragments ( TDFS ) were identified and sequenced. Four TDFswere exp ressed specifically in
CMS line, whereas 15 others could be detected only in the maintainer line. The analysis of sequence homology
and functional classification indicated that three TDFS com ing from CMS line shared high identities with m ito2
chondrial or ribosomal RNA genes of tomato and tobacco. 12 TDFS from maintainer line were highly homolo2
gous to known sequences. These genes m ight be related to transcrip tion, defense response, electron transport
and energy pathway, DNA or RNA2mediated metabolism, p rotein metabolism, transport, unknown or putative
p rotein and so on. It is speculated that the occurrence of CMS in pepper m ight involve different metabolism
pathways.
Key words: Capsicum annuum L. ; CMS; gene exp ression; cDNA2AFLP
植物细胞质雄性不育 ( cytop lasm ic male sterility, CMS) 是不能产生有功能花粉的一种母系遗传现
象。蕾期相关基因的突变最有可能干扰花药和花粉的正常发育 , 从而导致雄性不育。因此研究不育系
与保持系蕾期基因的表达差异对揭示 CMS的分子机理具有重要的理论意义。 cDNA2AFLP作为分析基
因表达差异的一种主要方法 , 已被广泛应用于植物雄性不育基因表达特征分析与功能基因克隆。
国内外学者分别从遗传机制 (王述彬 , 2005)、细胞学水平 (耿三省 等 , 1994; 王述彬 等 ,
2004; 何长征 等 , 2008)、生理生化水平 (邹学校 等 , 2004; 刘金兵 等 , 2006; 沈火林 等 , 2006)
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和分子水平 ( Zhang et al. , 2000; 张宝玺 等 , 2003; W ang et al. , 2004; Kim et al. , 2007) 就辣椒
(Capsicum annuum L. ) CMS的机理进行了探索。本研究中利用 cDNA2AFLP技术分析辣椒细胞质雄性
不育系及其相应保持系花蕾基因表达的差异 , 并对来自两系的特异表达 DNA片段进行克隆、测序、
同源性比对分析和功能分类 , 以期为深入探讨辣椒 CMS的分子机理提供依据。
1　材料与方法
辣椒细胞质雄性不育系 ‘北 A’与相应保持系 ‘北 B’ (连续回交 8代 ) 由华南农业大学园艺学
院蔬菜学系提供。不育系花药干瘪瘦小 , 成熟花药不开裂 , 不育率 100% , 雌蕊发育正常 , 其它性状
与保持系基本一致。试材于 2006年秋季种植于华南农业大学蔬菜试验基地 , 常规栽培管理。盛花期
随机选取生长势基本一致的植株各 20株 , 分别取小花蕾 (未露花冠 , 萼片紧闭 , 约 119 mm ×212
mm)、中花蕾 (花萼花冠齐平 , 约 311 mm ×316 mm) 和大花蕾 (花冠比花萼稍长 , 约 314 mm ×418
mm) 提取总 RNA。转化受体菌 E1coli DH5α菌株由园艺生物技术研究所提供 , 克隆载体 pMD192T购
自 Takara公司。
花蕾总 RNA的提取采用 Trizol法 ( Invitrogen公司 ) , 按使用说明操作。115%普通琼脂糖凝胶电
泳检测 RNA的完整性 , 同时用核酸蛋白仪测定 RNA的浓度。分别将来自 ‘北 A’和 ‘北 B’大、
中、小花蕾的总 RNA等量混合 , 构建不育与可育总 RNA池 , 反转录合成 cDNA。
cDNA2AFLP分析参考王永勤等 (2003) 的方法 , 扩增产物在 6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离 ,
银染检测。用手术刀片切下凝胶中的 cDNA差异条带 , 放入 015 mL离心管中 , 加入 50μL ddH2 O 室
温浸泡过夜 , 沸水浴 20 m in, 室温 12 000 r·m in21离心 10 m in, 留上清。取 5μL作为二次 PCR的模
板 , 采用相应的选扩引物组合扩增。PCR扩增体系为 50μL: 模板 510μL, 引物 A (50 ng·μL - 1 ) 1
μL, 引物 T (50 ng·μL - 1 ) 110μL, 10 ×PCR buffer (含 20μmol·L - 1 MgCl2 ) 510μL, Taq DNA
Polymerase (5 U·μL - 1 ) 015μL , dNTPs (10 mmol·L - 1 ) 018μL, ddH2O 3617μL。PCR扩增程序
为 : 94 ℃预变性 5 m in; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 30个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in, 4 ℃下保
存。PCR产物经 210%的琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化 , 连接到 pMD192T克隆载体上 , 用热激法转
化至大肠杆菌 E1coli DH5α中 , 选取经鉴定的重组子 , 委托上海英骏生物技术公司测序 , 核苷酸序列
的查询和比对使用 NCB I数据库 BLAST 网络服务工具 ( http: / /www1ncbi1nlm1nih1gov/blast/
blast1cgi)。
2　结果与分析
211选扩引物的筛选
共利用了 128对选择性扩增引物进行了 cDNA2AFLP分析。结果表明 , 除含有 A14的 8对引物扩
增效果不好外 , 其余 120对引物 , 每对引物均能扩增出 30～50条清晰稳定的条带 (部分结果见图
1)。从不育系 ‘北 A’与保持系 ‘北 B’扩增所获得的带型大部分相同 , 仅有少量差异片段 , 证实
了两者在遗传背景上的高度一致。在扩增获得的差异片段中还存在质与量的差异 , 即一些差异片段仅
在不育系或保持系中得到扩增 , 另一些差异片段在两系中均能扩增 , 但得到的扩增条带强弱不同。
212差异条带的获得
共筛选获得 19条在不育系或保持系蕾期稳定表达、重复性高的 cDNA差异条带 , 其中不育系特
有的差异带 4条 (A8T72S、A17T62S、A19T72S和 A19T82S) , 保持系特有的 15条 (图 2)。不育系特
有的差异片段数明显少于保持系 , 预示不育系中某些基因的沉默或保持系中某些基因的特异表达直接
导致了两者育性的差异。
2131
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　　电泳结果显示 , 上述 19条差异片段大小大多集中于 100～350 bp, 与 cDNA2AFLP扩增获得的相
应条带大小一致 , 且条带清晰单一 (图 3) , 浓度高。对 19条带进行了克隆和测序 , 结果 (略 ) 表
明 , 所克隆的条带去除两端引物后 , 最小片段为 55 bp (A4T102F) , 最大片段为 312 bp (A6T112F)。
图 3　19条差异片段二次扩增后的回收结果
F ig1 3　Gel extraction product of the 19 d ifferen tly expressed fragm en ts after the second PCR
M: DL2000 marker; 1 - 19: A4T42F, A4T62F, A4T102F, A6T42F, A6T112F,
A7T62F, A8T52F, A8T72S, A9T62F, A10T82F, A12T92F, A13T72F, A15T102F, A16T52F, A17T62S,
A17T62F, A18T102F, A19T72S and A19T82S.
213　差异片段的序列分析与功能分类
对 19条差异片段进行序列比对的结果表明 , 众片段之间没有重复 , 分别代表 19个不同基因的非
重复序列片段。在 GenBank数据库中对 19条差异片段 ( transcrip t2derived fragments, TDFs) 序列进行
BLAST比对分析 , 检索得到的有关功能信息见表 1。
表 1　差异片段的同源性比对结果
Table 1　Hom ology ana lysis of the d ifferen tia l fragm en ts to sequences in the da taba ses
片段名称
Fragment name
长度 / bp
Length
同源序列功能及序列号
Functions of homologous sequences and sequence number
相似性 /%
Identity
E值
E value
A8T72S 265 番茄线粒体基因组 gb | FJ37497411 | Solanum lycopersicum m itochondrial genome 94 3e2119
A17T62S 311 18S核糖体 RNA基因 gb |DQ24402211 | 18S ribosomal RNA gene 99 2e2155
A19T72S 213 番茄线粒体基因组序列 96 5e253
gb | FJ37497411 | Solanum lycopersicum m itochondrial genome sequence
A19T82S 212 预测蛋白质 ref | XP_00163910411 | p redicted p rotein 23 0151
A4T42F 254 马铃薯反转录转座子阻滞蛋白 54 9e225
gb |AB I3435411 | Solanum dem issum retrotransposon gag p rotein
A4T62F 152 DNA介导的 DNA聚合酶 ref | XP_00134840811 | DNA2directed DNA polymerase 35 217
A4T102F 55 烟草 mRNA dbj|BP13308211 | N icotiana tabacum cDNA clone BY5312 88 01002
A6T42F 122 烟草 mRNA gb | CV02151411 | N icotiana tabacum cDNA clone tbt_010985 76 2e208
A6T112F 312 马铃薯 mRNA gb | CV50462711 | M ixed floral Solanum tuberosum cDNA clone 71183 86 9e276
A7T62F 168 拟南芥乙二醛氧化酶相关蛋白 62 4e214
ref |NP_19132111 | A rabidopsis thaliana glyoxal oxidase2related
A8T52F 182 拟南芥 ABC转运体家族蛋白 73 2e218
ref |NP_18792812 | A rabidopsis thaliana ABC transporter fam ily p rotein
A9T62F 269 拟南芥氧结合蛋白和细胞色素 P450基因 70 2e227
ref |NP_17710913 | oxygen binding [A rabidopsis tha liana ] ,
gb |AAG6011111 |AC073178_22 cytochrome P450 , putative
A10T82F 281 蓝桉纤维素合成酶亚基 82 6e240
dbj |BAF9320211 | Eucalyptus g lobules cellulose synthase catalytic subunit
A12T92F 165 雏菊尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因 66 3e215
dbj |BAD7794411 | Bellis perennis UDP2glucuronic acid: Anthocyanin
glucuronosyl transferase
A13T72F 134 胡萝卜半胱氨酸蛋白酶基因 dbj |BAD2995411 | D aucus carota cysteine p rotease 90 9e217
A15T102F 93 马铃薯 mRNA gb | CV50267911 | M ixed Floral Solanum tuberosum cDNA clone 69088 79 4e216
A16T52F 122 葡萄未命名的蛋白 emb | CAO1656011 | V itis vin ifera unnamed p rotein p roduct 82 3e210
A17T62F 112 番茄 108前体蛋白 92 3e207
GENE ID: 544145 LOC544145 | Solanum lycopersicum p rotein 108 p recursor
A18T102F 199 番茄转录因子 GENE ID: 544194 THM1 | Solanum lycopersicum transcrip tion factor 80 2e218
　　注 : S表示差异片段克隆自不育系 , F表示差异片段克隆自保持系。
Note: S means the differential fragments cloned from CMS line and F means cloned from maintainer.
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　9期 吴智明等 : 辣椒胞质雄性不育系与保持系蕾期基因表达差异分析 　
在相似性较高的 12个基因中 , 来源于番茄和马铃薯的有 7个 , 来自拟南芥和烟草的分别有 3个
和 2个 , 没有找到来源于辣椒同源性较高的基因信息。可见本研究中得到的全部 TDFs在辣椒中属首
次报道。
对 4条在不育系中特异表达的谱带进行 BLAST搜索发现 , 有 3条与已知序列具有较高的相似性 ,
其中 A8T72S与番茄线粒体基因组部分序列的相似性达到 94% , 与矮牵牛线粒体基因组中 nad4L 2orf25
内部序列存在 98%的相似性 ; A17T62S与一个 18S核糖体 RNA基因的相似性达到 99% ; A19T72S与
番茄线粒体基因组部分序列的相似性达到 96% , 同时还与烟草线粒体基因组中核糖体蛋白 L2和
NADH脱氢酶亚基 9的部分序列存在 92%的相似性。对 15条在保持系中特异表达的谱带进行 BLAST
比对发现 , 有 12条可以找到相似性较高的序列。将这些 TDFs的功能以及同源性进行基因功能分类 ,
它们分别包括转录调控、防卫和胁迫反应、电子传递和能量途径、DNA或 RNA代谢、蛋白质代谢、
转运通道、未知或假定蛋白等。
3　讨论
作者从基因及基因表达产物入手 , 研究同核异质的不育系与保持系花蕾基因的表达差异 , 获得了
19条不育系与保持系差异表达的 TDFs, 其中有 4条在不育系中增强或特异表达 , 其余 15条在保持系
中增强或特异表达 , 在保持系中找到的差异表达条带多于相应的不育系 , 与吴建勇等 ( 2006) 对甘
蓝型油菜雄性不育和蒋明 (2007) 对白菜 polima胞质雄性不育的研究结果一致。原因可能是在花粉
败育关键时期到完全败育过程中 , 不育系雄配子的发育逐步终止 , 而保持系雄配子继续正常发育 , 即
不育系中某些基因的沉默或保持系中某些基因的特异表达直接导致了两者的差异。
对获得的 4条在不育系中增强或特异表达的条带进行同源性比对的结果表明 , 有 3条与番茄、矮
牵牛和烟草线粒体或核糖体能量代谢相关基因有较高的相似性 , 推测相关基因的特异表达可能通过调
节花药的呼吸代谢影响辣椒花药的发育。对来自保持系中能找到同源序列的 12条 TDFs的功能以及同
源性进行分类的结果表明 , 它们包括转录调控、防卫和胁迫反应、电子传递和能量途径、DNA 或
RNA代谢、蛋白质代谢、转运通道、未知或假定蛋白等。这些结果与康俊根等 ( 2006 ) 和黄鹂
(2007) 分别研究甘蓝和白菜不育系与保持系花蕾转录组差异分析的结果一致。推测辣椒 CMS的发生
可能受到多条代谢途径的共同调控。对获得的 TDFs进行基因功能分类时发现 , 其中有两个 TDFs
(A9T62F、A13T72F) 与植物防卫和胁迫反应相关。是否可以推测辣椒细胞质雄性不育的发生可能与
玉米 T型细胞质雄性不育相类似 , 即不育基因的编码产物是一种细胞毒素蛋白 , 由于它的产生试图
打乱植物本身正常的生长发育 , 从而促使植物作出一系列的防卫与应答反应。能否用研究植物受逆境
胁迫的应答机理的思路来研究辣椒细胞质雄性不育的分子机理 , 值得进一步研究。
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