全 文 ：第 19 卷
第 1 期

Vol. 19
No. 1
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2011 年
1 月

Jan.

2011
青贮饲料中乳酸菌的分离鉴定及优良菌株筛选
张慧杰1, 玉
柱2 , 王
林1 , 蔡义民3 , 李
峰4, 陶
雅4 , 孙启忠4*
( 1.中国农业科学院研究生院, 北京
100081; 2.中国农业大学草地研究所, 北京
100094; 3.日本畜产草地研究所,
枥木县那须郡, 日本
329
2793; 4.中国农业科学院草原研究所, 内蒙古 呼和浩特
010010)
摘要: 为研究青贮饲料中乳酸菌的分类及形态学与生理生化特性, 从苜蓿( Medicago sativ a L . )及玉米( Zea may s
L. )青贮饲料中分离得到 5株乳酸菌。经 16S rRNA 序列分析, 2 株( GI7, G I24)为乳酸片球菌 (P ed iococcus acidi

lactici ) , 其余 3 株( G I11, GI44, GI62)分别为戊糖片球菌( Pediococcus p entosaceus )、弯曲乳杆菌( L acto bacillus cur

v atus )和植物乳杆菌( L actobacillus p lantarum) ; 5 株菌均为同型发酵乳酸菌, 除弯曲乳杆菌 GI44 在 pH 3. 0, 4. 0,
8. 0 等条件下不能生长外, 其余菌株均可在 5, 10, 40, 45
等不同温度条件下、pH 3. 0~ 8. 0 等环境下以及 3. 0% 和
6. 5% NaCl溶液中良好生长或微弱生长。同时, 通过产酸速率和生长曲线等指标筛选出产酸较快、生长迅速的
GI62 可作为制备乳酸菌青贮饲料添加剂的优良菌株。
关键词:青贮; 乳酸菌;优良菌株
中图分类号: S816. 53



文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2011) 01
0137
05
Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from
Silage and Filtering of Excellent Strains
ZHANG Hui
jie1 , YU Zhu2 , WANG Lin1 , CA I Yi
min3 , L I Feng4 , TA O Ya4 , SU N Qi
zhong 4*
( 1. Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081, China; 2.China Agriculture University, Beijing 100094, China; 3.Nat ional
Inst itute of Livestock and Grassland Science, Nasushiobara 329
2793, Japan; 4. Grassland Research Institute, CAAS, Hohhot , Inner Mongolia 010010, China)
Abstract: T o study the tax onom ic, morpho logic, physiolog ical and bio chem ical characterist ics of lact ic acid
bacteria( LAB) in silage, five st rains of LAB wer e isolated from alfalfa ( Med icago sativa L. ) and maize
( Zea may s L. ) silag e. T he 16S rRNA sequence analy sis indicate that tw o st rains are P ediococcus p entosa

ceus( GI7, GI24) , and the o ther three are P ediococcus acidilacti ci , L actobacil lus curv atus and L actobaci l

lus p lantar um ( GI11, GI44, GI62) . Each is homo fermentat ive lact ic acid bacteria and can gr ow w ell o r
w eakly at 5, 10, 40, 45
, and w ith pH3. 0~ 8. 0, 3. 0% and 6. 5% NaCl except that GI44 does not gr ow
at pH3. 0, 4. 0, 8. 0. Through measuring the rate o f lact ic acid product ion and the g row th curve, GI62 w as
selected as exim ious str ain used for pr eparing lact ic acid bacteria addit iv e due to it s rapid acid
pr oduct ion
and gr ow th speed.
Key words: Silage; Lact ic acid bacteria; Eximious strain


青贮是通过乳酸菌的增殖, 将原料中的发酵底
物(可溶性糖)转化成乳酸等酸性物质, 创造酸性环
境,抑制有害微生物增殖,从而保存原料营养成分的
过程[ 1] 。优质青贮饲料不仅保持了青绿饲料的鲜绿
和大部分营养, 而且增加了粗蛋白的含量 [ 2] ;同时又
具有芳香的酸味, 柔软多汁, 适口性好等特点 [ 3~ 5]。
众所周知,欧盟国家和美国的研究者对乳酸菌在青
贮饲料中的应用进行了大量深入的研究, 研究内容
包括优良乳酸菌的筛选 [ 6]、其对青贮饲料发酵品质
和二次发酵抑制作用的影响[ 7] 、以及青贮饲料添加
乳酸菌在奶牛饲养中的应用等。在我国, 青贮饲料
乳酸菌添加剂方面的研究应用还显得十分薄弱, 迫
切需要加强。本研究旨在从自然发酵的优质青贮饲
料样品中分离、选择乳酸菌优良菌株,为我国饲草青
贮饲料乳酸菌的研究、开发利用提供参考。
1
材料与方法
1. 1
青贮样品
2009年 7月初选取内蒙古赤峰市林西县良种场
收稿日期: 2010
11
10;修回日期: 2010
12
01
基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金;公益性行业(农业)科研专项经费项目
( nyh yz x07
022) ;
948
项目( 2010
G15) ;内蒙古自治区自然科学基金项目( 2010MS0402)资助
作者简介:张慧杰( 1986
) ,女,内蒙古锡林郭勒盟人,硕士研究生,研究方向为牧草加工利用, E
mail: zh j439389793@ yahoo. com. cn; * 通
讯作者 Author for correspendence, E
mail : sunqz@ 126. com
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报 第 19卷
( E117
38
~ 118
37
, N43
14
~ 44
15
)生长 4 年的
6个紫花苜蓿( Med icago sat iv a L. )品种及 1 个玉
米( Zea may s L. )品种 (见表 1) , 苜蓿于初花期刈
割,玉米于乳熟期刈割,铡短( 2~ 3 cm) ,分别装入聚
乙烯袋,每袋约 150 g, 用真空包装机抽成真空并封
口。青贮第 1, 2, 3, 35, 45天时对各试验材料分别进
行乳酸菌的分离与鉴定。
表 1
试验材料的种类及品种名
T able 1
Varieties and cultiv ars of exper imental mater ials
样品编号
S am ple number
品种名称
Cult ivars nam e
种类
Varieties
1 rangelander 杂花苜蓿
2 阿尔冈金 紫花苜蓿
3 润布勒 紫花苜蓿
4 准格尔 紫花苜蓿
5 甘农 3号 紫花苜蓿
6 敖汉 紫花苜蓿
7 科多 8号 玉米
1. 2
仪器设备
恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜( OLM

PUS)、立式压力蒸汽灭菌器、PCR仪、超低温冰箱、
凝胶成像仪、电泳仪、紫外分光光度计。
1. 3
培养基及试剂
MRS培养基购自 Difco Laboratories ( Detroit ,
USA) ; Sapphire Amp Fast PCR M aster M ix 购自
日本株式会社。
1. 4
试验方法
1. 4. 1
乳酸菌的分离与纯化
将 5 g 青贮样品和
45 mL 无菌水混匀,并用无菌水按照 10- 1到 10- 5进
行梯度稀释, 选取适当的浓度, 利用平板划线法在
37
厌氧环境下、MRS 培养基上进行菌落培养。
48 h 后计数,并挑取典型菌落, 进行革兰氏染色、镜
检。凡是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株,继续
分离纯化培养。分离到的乳酸菌在 MRS培养基上
纯化 2次。菌株保藏在营养肉汤培养基中(其中加
入 10%的二甲基亚砜) , - 80
保存。
1. 4. 2
乳酸菌的形态学与生理生化特性检测
乳
酸菌在MRS培养基上培养 24 h后进行革兰氏染色
和形态学检测。过氧化氢酶活性检测及发酵葡萄糖
产气试验按照凌代文等[ 8] 的方法进行。选择在 5,
10, 40和 45
等不同温度条件下进行生长试验, 其
中 5
和10
条件下培养 14 d; 40
和 45
条件下
培养 7 d, 分别在 pH3. 0, 3. 5, 4. 0, 4. 5, 5. 0, 7. 5 和
8. 0条件下培养 7 d,观察乳酸菌的生长状况 [ 9]。分
别在 3. 0%和 6. 5% NaCl 溶液中观察乳酸菌的耐
盐能力。
1. 4. 3
乳酸菌菌株的 16S rRNA序列测定
1. 4. 3. 1
PCR 扩增 16S rRNA 基因序列
菌株
16S rRNA PCR 扩 增 引 物 序 列 为 27f : 5


AGAGTT TGAT CCT GGCTCAG
3
和 1492r: 5


AAGT CGTAACAAGGTAA CC
3
, 由北京奥科生
物技术有限责任公司合成, PCR扩增片段约为 1500
bp; PCR反应体系( 50
L) : SapphireAmp Fast PCR
M aster M ix 25
L, 引物 27f ( 20 pm )和 1492r ( 20
pm)各0. 5
L, 双蒸水24
L, 挑取培养24~ 48 h的
新鲜菌落, 与反应体系混匀; PCR 循环参数如下:
94
预变性 5 m in, 98
变性5 s, 55
退火 5 s, 72

延伸 20 s, 共 40个循环; 预先制备 1. 0%的琼脂糖
凝胶,扩增反应完毕后,取 5
L PCR产物与 5
L 的
6
Loading Buffer 混合,加样于琼脂糖凝胶点样孔
中进行电泳, 电压为 5 V
cm- 1 , 电泳液为 0. 5

T AE。电泳后,用溴化乙锭染色 25 m in, 凝胶成像
仪下观察。如果 PCR 成功, 则可见到约为 1500 bp
的条带。
1. 4. 3. 2
16S rRNA序列测序
将保存的 PCR产
物送样测序,测序工作由上海桑尼生物科技有限公
司完成,所用仪器为 ABI 公司的测序仪。
1. 4. 3. 3
16S rRNA 序列同源性分析与系统发育
树的构建
利用 BLAST ( http: / / www . ncbi. nlm.
nih. gov / BLAST ) , 将所测定菌株的 16S rRN A 序
列与 GenBank/ EMBL/ DDBJ数据库中已知细菌的
16S rRN A序列进行比较鉴定, 寻找与目的基因序
列同源性最高的已知分类地位的菌种。然后从
GenBank/ EMBL/ DDBJ数据库中,提取已知的标准
菌株的 16S rRNA 基因序列, 与测定菌株的 16S
rRNA序列, 共同用 DNA star 软件以 ClustalW 进
行校准排齐,绘制系统发育树。
1. 4. 4
优良乳酸菌菌株筛选与确定
将分离并鉴
定的乳酸菌分别按 3%的接种量传入 MRS 液体培
养基中, 37
恒温培养。主要根据菌株的产酸能力,
生长特性来筛选适宜用作青贮饲料的菌株。
1. 4. 4. 1
产酸速率测定
每隔 2 h 测定不同菌株
发酵液 pH ,绘制的产酸速率曲线是不同发酵时间
( h)对应发酵液 pH 值的变化。
1. 4. 4. 2
生长曲线的测定
用待测菌株 24 h 的培
养液,以 3%的接种量接入 MRS 液体培养基中, 于
37
培养箱中培养 36 h, 每隔 2 h取一次样品,放于
4
冰箱中, 最后以培养基为空白, 在 620 nm 下测
138
第 1期 张慧杰等:青贮饲料中乳酸菌的分离鉴定及优良菌株筛选
定样品的吸光度值, 同时测定 pH 值,以培养时间为
横坐标, 相对应的吸光值, pH 值为纵坐标, 绘制生
长曲线。
2
结果与分析
2. 1
乳酸菌的形态学与生理生化特性
表 2为实验分离到的 5株乳酸菌菌株, 其中 4
株分离自 3 个苜蓿品种, 1株分离自玉米。经实验
检测, 5株菌均为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、同
型发酵乳酸菌, 能够在 5
和 10
, pH5. 0, 7. 5 以
及 3. 0%和 6. 5% NaCl等条件下生长。除菌株 GI44
在 5
, 40
, pH3. 5, 4. 5 等条件下微弱生长, 在
pH3. 0, 4. 0, 8. 0 不能生长外, 其余菌株均可在 5,
10, 40, 45
、含 3. 0%和 6. 5% NaCl、pH3. 0~ 8. 0
范围内生长或微弱生长(见表 3)。
表 2
青贮中分离的乳酸菌菌株
Table 2
I so lated Lactic acid bacteria fr om silage
菌株编号
St rain n umber
样品名称
S am ple name
发酵时间
Ferm entation t ime
GI7 敖汉 2 d
GI11 敖汉 45 d
GI24 阿尔刚金 35 d
GI44 甘农 3号 3 d
GI62 科多 8号 45 d
表 3
青贮饲料中乳酸菌的特性
T able 3
Characterist ics o f lactic acid bacter ia fr om silage
项目 Item s GI7 GI11 GI24 GI44 GI62
菌形状
Shape
球菌
Coccus
球菌
Coccu s
球菌
C occus
杆菌
Rod
杆菌
Rod
革兰氏染色
Gram stain
+ + + + +
过氧化氢酶反应
Catalas e
- - - - -
发酵类型
Fermentat ion ty pe
同型发酵
H omo
同型发酵
H omo
同型发酵
Homo
同型发酵
H omo
同型发酵
H omo
5
+ + + w +
10
+ + + + +
40
+ + + w +
45
+ + + + +
3. 0% NaCl + + + + +
6. 5% NaCl + + + + +
pH 3. 0 w w w
w
pH 3. 5 + w + w +
pH 4. 0 + + +
+
pH 4. 5 + + + w +
pH 5. 0 + + + + +
pH 7. 5 + + + + +
pH 8. 0 + + +
+


注: + 表示生长,
表示不生长,W 表示弱生长
Note: + mean s posit ive; - means negat ive; W mean s weakly posit ive
2. 2
乳酸菌菌株 16S rRNA序列测定及系统进化
树的构建
经 BLAST 比较鉴定, 5 株菌与标准菌株的序
列相似性均达到了 99%。由图 1可知, 3株菌属于
片球菌属( Pediococcus) , 2株菌属于乳杆菌属( L ac

tobaci l lus) ,其中 GI7和 GI24均为乳酸片球菌( P e

diococcus acidi lact ici ) , GI11为戊糖片球菌( Pedio

coccus p entosaceus ) , GI44为弯曲乳杆菌( L actoba

cil lus curv atus ) , GI62为植物乳杆菌( L actobacil lus
p lantar um )。用于构建系统发育树的乳酸菌参考
菌株见表 4。
2. 3
乳酸菌产酸能力比较
由图 2可知, 5株乳酸菌具有相似的产酸速率,
即: 0~ 4 h产酸速率较快, 4~ 6 h逐渐变缓, 8~ 12 h
趋于平稳; 5株菌发酵 12 h后 pH 值分别达到 4. 27,
4. 20, 4. 31, 4. 30和 3. 91,在 MRS液体培养基中 GI62
产酸能力最强,与其余4株菌差异显著( P< 0. 05)。
139
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图 1
所测菌株 16S rRNA序列系统进化树
F ig . 1
Phylogenetic t ree of 16S rRNA sequences of tested st rains
表 4
用于构建系统发育树的乳酸菌参考菌株
T able 4
Refer enced Lactic acid bacter ia stra in fo r
constructing phylog enetic tr ee
参考菌株
Refer enced st rain s
GenBank No.
戊糖片球菌( P . p entosac eus) DSM 20336 ( T) AJ305321
乳酸片球菌( P . ac id i lac ti ci) DSM 20284 ( T ) AJ305320
弯曲乳杆菌( L . cur vatu s) DSM 20019 AM113777
植物乳杆菌( L . p lantarum) JCM_1149 HM162417
图 2
乳酸菌的产酸速率曲线
Fig. 2
Rate o f lactic acid product ion in LAB
2. 4
乳酸菌生长曲线的测定
由图 3可知, 5株菌均在2~ 4 h时开始进入对数
生长期,在 4~ 8 h 时生长速度达到最快, 8~ 10 h开
始进入稳定期,此后pH 值和OD值变化都较小,但都
稍有增加的趋势; 3株菌( GI11, GI44, GI62)在发酵过
程中没有明显的迟滞期,说明在 MRS液体培养基中
的代谢活动比较快,能很快进入细胞的分裂期,使细
胞数目快速增长,进而产生大量乳酸,使 pH 快速降
低,抑制青贮原料中的酵母菌、霉菌以及腐败菌的生
长; 5株菌发酵 36 h 的 OD 值分别为 2. 79, 2. 76,
2. 81, 2. 38和 2. 88, 在 MRS 液体培养基中 GI62 的
生长速度最快, 与其余 4株菌差异显著( P< 0. 05)。
图 3
乳酸菌的生长曲线
Fig . 3
Grow th curve of LAB
3
讨论
乳酸菌在饲草青贮发酵过程中起着重要的作
用,其种类和数量对饲草发酵品质有较大的影响。
16S rRN A具有功能和进化上的同源性, 其序列进
化变异频率缓慢, 在整体结构上极端保守,并且 16S
rRNA分子大小适中, 携带有充分的生物信息可用
来进行可靠的系统进化分类。16S rRNA 序列分析
可以快速、准确地对微生物进行分类鉴定,基于 16S
rRNA建立的系统进化树可以确定微生物在进化中
的位置。本试验中, 分离到的 5 株菌的 16S rRNA
序列与参考菌株的 16S rRNA 序列相似性都在
99%以上, 因此可把 GI7 和 GI24 鉴定为乳酸片球
菌, GI11鉴定为戊糖片球菌, GI44鉴定为弯曲乳杆
菌, GI62鉴定为植物乳杆菌。
在优良菌株的筛选指标中, 产酸速率是一个非
常重要的指标。产酸速率是乳酸菌活力良好的重要
特征之一, 不同的菌株存在很大的差异。McDonld
等[ 1 0]和Woo lfor d[ 11]提出, 用作青贮菌制剂的微生
140
第 1期 张慧杰等:青贮饲料中乳酸菌的分离鉴定及优良菌株筛选
物应具有均一发酵途径, 可快速发酵乳糖产生最大
量的乳酸, 能发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖, 尤其
是戊糖,有耐酸的能力, 能快速降低 pH 值, 至少使
pH 值最终达 4. 0,以抑制其他微生物。本试验中,
GI7, GI11, GI24, GI44, GI62 共 5 株菌在发酵 12 h
后的 pH 值分别为 4. 27, 4. 20, 4. 31, 4. 3和 3. 9, 产
酸能力最强的是植物乳杆菌 GI62, 乳酸杆菌较乳酸
球菌具有更强的产酸能力。5 株菌发酵 36 h 的吸
光度值分别为 2. 79, 2. 76, 2. 81, 2. 38和 2. 88, 发酵
速度最快的是植物乳杆菌 GI62, 适温条件下乳酸杆
菌的活力及生长速度均优于乳酸球菌。综合 2项指
标,在分离到的 5株乳酸菌中,最适宜做青贮饲料乳
酸菌添加剂菌种的是植物乳杆菌 GI62。
实际上, 大多数乳酸菌青贮添加剂至少都包括
植物乳杆菌,但也经常使用一些其他的乳杆菌。乳
酸菌青贮添加剂产品范围非常广, 1988 年市场上至
少就有 40种 [ 12]。在 pH5. 0以上, 厌氧条件下, 植
物乳杆菌通常很难生长, 因此,乳酸菌青贮添加剂通
常都是植物乳杆菌和其他菌种结合组成的混合物。
大多数情况下, 大家都选用屎肠球菌( Enterococcus
f aecali s) ,因为其更适合青贮发酵的初始条件,片球
菌也广泛用于与植物乳杆菌一起组成青贮添加剂。
现在也有在青贮饲料中使用枯草芽孢杆菌( Baci l

lus subti li s )的, 因为其能产生淀粉酶、复合纤维素
酶,能将多糖分解成单糖,为乳酸菌的增殖提供良好
的条件。
GI62是否可以作为添加剂菌种还需要小规模
发酵试验来验证,相关试验正在进行中。
4
结论
4. 1
从苜蓿及玉米青贮饲料中分离出 5株乳酸菌,
经 16S rRNA 序列分析, 2株为乳酸片球菌, 其余 3
株分别为戊糖片球菌、弯曲乳杆菌和植物乳杆菌, 其
中植物乳杆菌 GI62产酸能力最强, 发酵速度最快,
特性优良,与其余 4株菌差异显著,适宜做青贮饲料
乳酸菌添加剂菌种。
4. 2
分离出的 5株菌均为同型发酵乳酸菌, 除弯曲
乳杆菌 GI44在 pH3. 0, 4. 0, 8. 0等条件下不能生长
外,其余菌株均可在5, 10, 40, 45
等不同温度条件
下、pH3. 0~ 8. 0 等环境下, 以及 3. 0%和 6. 5%
NaCl溶液中良好生长或微弱生长。
参考文献
[ 1]
玉柱,贾玉山,张秀芬. 牧草加工贮藏与利用 [ M ] . 北京:化学
工业出版社, 2004. 35
37
[ 2]
Steen R W J, Unsw orth E F, Gracey H L, e t al . Evaluation
studies in th e development of a cammercial bacterial in oculant
as an addit ive for grass s ilage. 3. Response in growin g cat t le
an d in teract ion w ith protein supplementat ion [ J ] . Gras s an d
Forage S cience, 1989, 44: 381
390
[ 3]
Yang X X, Ch en H Z, Gao H L, et al . Bioconversion of corn
st raw by cou pling ensiling and solid state fermentat ion [ J ] .
Biores ou r T echnology, 2001, 78: 277
280
[ 4]
Weinberg Z G, Ashbel l G, Chen Y. Stabilizat ion of returned
dai ry produ cts b y ensiling with st raw and molasses for animal
feeding[ J] . Journ al of Dairy Science, 2003, 86: 1325
1329
[ 5]
Filya I. T he effect of Lactobaci l lus buch neri and Lac tobaci l lu s
p lantar um on the fermentat ion, aerobic stabilit y, an d rum inal
degradabilit y of low dry mat ter corn an d sorghum silages [ J ] .
Journ al of Dairy Science, 2003, 86: 3575
3581
[ 6]
Cai Yimin. Ident if icat ion and ch aracterizat ion of enter ococcus
species isolated f rom forage crops and their influen ce on silage
fermentat ion[ J ] . Journal of Dairy Science, 1999, 82: 2466
2471
[ 7]
Weinberg Z G, S zakacs G, Ash bel l G, et al . Th e Ef fect of L ac

t obaci llus bu chner i and L . p lantarum, appl ied at ensil ing, on
the ens iling ferm entation and aerobic stabilit y of w heat an d
sorghum s ilages[ J ] . Journal of Indust rial M icrob iology & Bio

t ech nology, 1999, 23: 218
222
[ 8]
凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[ M ] .北京: 中
国轻工业出版社, 1999
[ 9]
Cai Y, Suyanandana P, Sam an P, e t al . Class ificat ion and char

acterizat ion of lact ic acid b acteria isolated f rom th e intest ines of
comm on carp and f resh w ater prawn s [ J ] . Journal of General
an d Appl ied Micr obiology, 1999, 45: 177
184
[ 10] MeDonald P, H end erson A R, Heron S J E. The bioch emis t ry
of silage [ M ] . Abersytw yth , UK: Chalcombe Publicat ions ,
1991
[ 11] Woolford M K. T he det rimental ef feet s of ai r on si lage [ J ] .
Journ al of Applied Bacteriology, 1990, 68: 101
112
[ 12] Anon. Si lage addit ives su pplem ent [ J] . Farmers Weekly, 1988,
54
57
(责任编辑
李美娟)
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