全 文 ：第２０卷 第１期
Ｖｏｌ．２０ Ｎｏ．１
草 地 学 报
ＡＣＴＡ ＡＧＲＥＳＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
２０１２年 １月
Ｊａｎ． ２０１２
山竹岩黄芪青贮中优质乳酸菌的分离和鉴定
司丙文１，王宗礼２＊，孙启忠２，徐春城３，李 峰２，陶 雅２
（１．中国农业科学院研究生院，北京 １０００８１；２．中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 ０１００１０；
３．中国农业大学工学院，北京 １０００８３）
摘要：从山竹岩黄芪（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｆｒｕｔｉｃｏｓｕｍＰａｌ．）青贮饲料中分离到３株乳酸菌（ＨＦ８４，ＨＦ６９，ＨＦ４９）。经传统
鉴定方法及１６ＳｒＲＮＡ序列分析，菌株 ＨＦ８４为蒙氏肠球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ），菌株 ＨＦ６９为乳酸乳球菌乳酸
亚种（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ），菌株ＨＦ４９为植物乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）。３株乳酸菌均为同型
发酵乳酸菌，蒙氏肠球菌在ｐＨ ３．０条件下不能生长，乳酸乳球菌乳酸亚种在ｐＨ ３．０、温度５℃时及６．５％ＮａＣｌ溶
液中不能生长，植物乳杆菌均可在试验设定条件下生长。通过测定３株乳酸菌的生长曲线和产酸速率，菌株 ＨＦ４９
生长速度快、产酸性能好，可作为制备乳酸菌青贮饲料添加剂的优良菌株。
关键词：山竹岩黄芪；青贮；乳酸菌；分离；鉴定
中图分类号：Ｓ８１６．５３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－０４３５（２０１２）０１－０１６６－０５
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ－Ｑｕａｌｉｔｙ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ
Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｆｒｕｔｉｃｏｓｕｍＰａｌ．Ｓｉｌａｇｅ
ＳＩ Ｂｉｎｇ－ｗｅｎ１，ＷＡＮＧ Ｚｏｎｇ－ｌｉ ２＊，ＳＵＮ Ｑｉ－ｚｈｏｎｇ２，ＸＵ Ｃｈｕｎ－ｃｈｅｎｇ３，ＬＩ Ｆｅｎｇ２，ＴＡＯ Ｙａ２
（１．Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｇｒａｓｓｌａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＡＳ，Ｈｏｈｈｏｔ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ０１００１０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｆｒｕｔｉｃｏｓｕｍＰａｌ．ｓｉｌａｇｅ．Ｔｈｅ
１６ＳｒＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ
（ＨＦ８４），Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ（ＨＦ６９）ａｎｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＨＦ４９），ａｌ ｗｅｒｅ ｈｏｍｏｆｅｒ－
ｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ．ＨＦ８４ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｇｒｏｗ ａｔ ｐＨ ３．０，ＨＦ６９ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｇｒｏｗ ｕｎｄｅｒ ｐＨ ３．０，５℃
ａｎｄ ６．５％ ＮａＣｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｗｈｉｌｅ ＨＦ４９ｃａｎ ｇｒｏｗ ｗｅｌ ａｔ ａｌ ｔｅｓｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ
ｒａｔｅ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ，ＨＦ４９ｃａｎ ｂｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｅｘｃｅｌｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ
ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｄｕｅ ｔｏ ｉｔｓ ｒａｐｉｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｓｐｅｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｆｒｕｔｉｃｏｓｕｍＰａｌ．；Ｓｉｌａｇｅ；Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
山竹岩黄芪（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｆｒｕｔｉｃｏｓｕｍＰａｌ．）为多
年生灌木豆科植物，其茎、叶、花果是高蛋白、高脂肪
的优质饲料，为家畜所喜食［１］。青贮是一种很好的饲
料利用方式，可通过乳酸菌的增殖，将原料中的可溶
性糖转化成乳酸等酸类物质，创造酸性环境，抑制有
害微生物的增殖，从而保存青贮饲料中的营养成分，
达到饲料长期存贮的目的［２］。在青贮饲料中含有多
种乳酸菌，包括乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、肠球菌（Ｅｎ－
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、明串珠菌（Ｌｅｕｃｏｎｓｔｏｃ）、乳球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃ－
ｃｕｓ）和片球菌（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）等［３，４］，为提高青贮品质，
分离饲料中优质乳酸菌显得尤为重要。本研究以山
竹岩黄芪为材料，对青贮过程中起重要作用的乳酸菌
的特性进行初步研究，并选出性状优良的乳酸菌，为
制备优良的青贮饲料发酵菌剂奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 青贮样品
２０１０年８月初选取内蒙古赤峰市林西县良种场人
工种植的山竹岩黄芪，初花期刈割，铡短（２～３ｃｍ），
收稿日期：２０１１－０８－１２；修回日期：２０１１－１１－０８
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（ＣＡＲＳ－３５）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（中国农业科学院草原研究
所）；内蒙古自治区自然科学基金项目（２０１０ＭＳ０４０２）资助
作者简介：司丙文（１９７５－），男，黑龙江佳木斯人，博士研究生，研究方向为草地资源保护与利用，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｉｂｉｎｇｗｅｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；＊通信作者
Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｚｏｎｇｌｉ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
第１期 司丙文等：山竹岩黄芪青贮中优质乳酸菌的分离和鉴定
装入聚乙烯袋，每袋约２００ｇ，用真空包装机抽成真
空并封口。
１．２ 培养基
ＭＲＳ培养基购自Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，
ＵＳＡ）。
１．３ 仪器设备
超净工作台、光学显微镜（ＯＬＭＰＵＳ ＢＸ５１）、立
式压力蒸汽灭菌器、超低温冰箱、ＰＣＲ仪、凝胶成像
仪、电泳仪、紫外分光光度计。
１．４ 乳酸菌的分离与纯化
在超净工作台中将青贮样品开封取样，剪碎，混
匀，称取５ｇ放入装有４５ｍＬ无菌水的１００ｍＬ三
角瓶中，摇床１８０ｒ·ｍｉｎ－１，室温振荡３０ｍｉｎ，并用
无菌水按照１０－１至１０－５进行梯度稀释，选取适当的
浓度，利用平板划线法在３７℃厌氧环境下，ＭＲＳ培
养基中培养４８ｈ后计数，并挑取典型菌落，进行革
兰氏染色、镜检。凡是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性
的菌株，继续分离纯化培养。
分离到的乳酸菌在 ＭＲＳ培养基上纯化２次。
纯化后菌株保藏在 Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ培养基中（其中
加入１０％的二甲基亚砜），－８０℃保存。
１．５ 乳酸菌的形态学与生理生化特性检测
乳酸菌在 ＭＲＳ培养基上培养２４ｈ后进行革兰
氏染色和形态学检测。过氧化氢酶活性检测及发酵
葡萄糖产气试验按照凌代文等［５］的方法进行。选择
在５，１０，４０，４５℃不同温度条件下进行生长试验，其
中５℃和１０℃条件下培养１４ｄ；４０℃和４５℃条件下
培养７ｄ，分别在ｐＨ ３．０，３．５，４．０，４．５，５．０，７．５，
８．０条件下培养７ｄ，观察乳酸菌的生长状况［６］。分
别在３．０％和６．５％ ＮａＣｌ溶液中观察乳酸菌的耐
盐能力。利用ＡＰＩ ５０ＣＨ 检测乳酸菌对４９种不同
碳源的同化能力。
１．６ 乳酸菌１６ＳｒＲＮＡ基因序列测定及系统进化
分析
对菌株１６ＳｒＲＮＡ基因片段进行扩增，引物序
列为２７ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′和
１４９２ｒ：５′－ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣ－３′，由上
海桑尼生物科技有限公司合成。ＰＣＲ反应体系（５０
μＬ）：２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（购自天根生化科技
有限公司）２５μＬ，引物２７ｆ和１４９２ｒ（２０ｐｍ）各２
μＬ，模板２μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ 补足至５０μＬ；ＰＣＲ扩增
程序：９４℃，５ｍｉｎ；９４℃，５０ｓ；５５℃，５０ｓ；７２℃延伸２
ｍｉｎ，３０个循环后，７２℃，１０ｍｉｎ；４℃保存。ＰＣＲ 扩
增产物在１．５％琼脂糖凝胶上电泳检测，如果ＰＣＲ
成功，则可见到约为１５００ｂｐ的条带。将ＰＣＲ扩增
产物送至上海生工生物工程有限公司正、反测序。
利用ＢＬＡＳＴ，将所测定菌株的１６ＳｒＲＮＡ序列与
ＧｅｎＢａｎｋ数据库中已知细菌的１６ＳｒＲＮＡ序列进
行比较鉴定，寻找与目的基因序列同源性最高的已
知分类地位的菌种。然后从ＧｅｎＢａｎｋ数据库中，提
取已知的标准菌株的１６ＳｒＲＮＡ基因序列，与测定
菌株的１６ＳｒＲＮＡ序列，共同用ＤＮＡ ｓｔａｒ软件以
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ 进行校准排齐，绘制系统进化树。
１．７ 产酸速率测定
将分离并鉴定的乳酸菌分别按３％的接种量传
入 ＭＲＳ液体培养基中，于３７℃培养箱中培养１２ｈ，
每隔２ｈ测定不同菌株发酵液ｐＨ 值，绘制的产酸
速率曲线是不同发酵时间（ｈ）对应发酵液ｐＨ 值的
变化［７］。
１．８ 生长曲线的测定
用待测菌株２４ｈ的培养液，以３％的接种量接
入 ＭＲＳ液体培养基中，于３７℃培养箱中培养３６ｈ，
每隔２ｈ取１次样品，放于４℃冰箱中，最后以液体
培养基为空白，在６２０ｎｍ下测定样品的吸光度值，
以培养时间为横坐标，相对应的吸光值为纵坐标，绘
制生长曲线。
２ 结果与分析
２．１ 分离乳酸菌生化鉴定
从山竹岩黄芪青贮中分离出 ３ 株乳酸菌
ＨＦ８４，ＨＦ４９和 ＨＦ６９。分离菌株的属种鉴定结果
如表１和表２所示，菌株 ＨＦ８４革兰氏染色阳性，短
链形状，过氧化氢酶阴性，兼性厌氧球菌，发酵葡萄
糖不产气，能在１０℃，４５℃生长，可在６．５％的ＮａＣｌ
培养液中生长，在ｐＨ ４．０及８．０条件下生长，能发
酵核糖、果糖、木糖、葡萄糖、纤维二糖、阿拉伯糖、乳
糖、鼠李糖、七叶灵、甘露糖、甘露醇、麦芽糖、山梨
醇、蜜二糖等，不能发酵松三糖、阿东醇，查阅《伯杰
细菌鉴定手册》［８］，符合蒙氏肠球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｎｄｔｉｉ）的特征，初步确定 ＨＦ８４为蒙氏肠球菌。
７６１
草 地 学 报 第２０卷
其中蒙氏肠球菌的很多特征同链球菌和乳球菌相
同，均具有典型的链状球形结构，肠球菌区别于链球
菌和乳球菌的主要特征就是可以在６．５％ＮａＣｌ溶
液中，以及在ｐＨ值９．６时可以生长［９］。
表１ 青贮饲料中乳酸菌的特性
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｓｉｌａｇｅ
特性Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ＨＦ８４ ＨＦ６９ ＨＦ４９
形状Ｓｈａｐｅ 球菌Ｃｏｃｃｕｓ 球菌Ｃｏｃｃｕｓ 杆菌Ｒｏｄ
发酵类型Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ 同型 Ｈｏｍｏ 同型 Ｈｏｍｏ 同型 Ｈｏｍｏ
过氧化氢酶Ｃａｔａｌａｓｅ － － －
革兰氏染色Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ ＋ ＋ ＋
５℃ ｗ － ＋
１０℃ ＋ ＋ ＋
４５℃ ＋ ＋ ＋
３．０％ＮａＣｌ ＋ ＋ ＋
６．５％ＮａＣｌ ＋ － ＋
ｐＨ３．０ － － ｗ
ｐＨ３．５ ｗ ｗ ＋
ｐＨ４．０ ＋ ＋ ＋
ｐＨ４．５ ＋ ＋ ＋
ｐＨ７．５ ＋ ＋ ＋
ｐＨ８．０ ＋ ＋ ＋
注：＋ 表示生长，－ 表示不生长，ｗ表示弱生长。下同
Ｎｏｔｅ：＋ ｍｅａｎｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ；－ ｍｅａｎｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ；ｗ ｍｅａｎｓ ｗｅａｋｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ．
Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｂｅｌｏｗ
表２ 青贮饲料中乳酸菌糖发酵鉴定结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｕｇａｒｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ
项目Ｉｔｅｍｓ ＨＦ８４ ＨＦ６９ ＨＦ４９
Ｌ－阿拉伯糖Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｓｅ ＋ ＋ ＋
核糖 Ｒｉｂｏｓｅ ＋ ＋ ＋
Ｄ－木糖 Ｄ－Ｘｙｌｏｓｅ ＋ ＋ －
阿东醇 Ａｄｏｎｉｔｏｌ － － －
葡萄糖 Ｇｌｕｃｏｓｅ ＋ ＋ ＋
果糖Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ＋ ＋ ＋
甘露糖 Ｍａｎｎｏｓｅ ＋ ＋ ＋
山梨糖Ｓｏｒｂｏｓｅ － ＋ －
鼠李糖 Ｒｈａｍｎｏｓｅ － ｗ －
甘露醇 Ｍａｎｎｉｔｏｌ ＋ ＋ ＋
山梨醇Ｓｏｒｂｉｔｏｌ － ＋ ＋
苦杏仁甙 Ａｍｙｇｄａｌｉｎ ＋ ＋ ＋
熊果苷 Ａｒｂｕｔｉｎ ＋ ＋ ＋
七叶灵Ｅｓｃｕｌｉｎ ＋ ＋ ＋
纤维二糖Ｃｅｌｏｂｉｏｓｅ ＋ ＋ ＋
麦芽糖 Ｍａｌｔｏｓｅ ＋ ＋ ＋
乳糖Ｌａｃｔｏｓｅ ＋ ＋ ＋
蜜二糖 Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ ｗ ＋ ＋
蔗糖Ｓｕｃｒｏｓｅ ＋ ＋ ＋
松三糖 Ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ － ＋ －
棉籽糖 Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ － － ＋
肝糖 Ｇｌｙｃｏｇｅｎ － － －
木糖醇 Ｘｙｌｉｔｏｌ － － －
Ｄ－松二糖 Ｄ－Ｔｕｒａｎｏｓｅ － ＋ ＋
Ｄ－塔格糖 Ｄ－Ｔａｇａｔｏｓｅ ＋ ＋ －
菌株 ＨＦ４９过氧化氢酶反应阴性，兼性厌氧，发
酵葡萄糖不产气，在ｐＨ３．５条件下能生长，能发酵
核糖、棉籽糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、
甘露糖、甘露醇、山梨醇、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、
苦杏仁甙等，不能发酵鼠李糖。能够在１０℃，４５℃
条件下生长，符合植物乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎ－
ｔａｒｕｍ）的特征，初步确定 ＨＦ４９为植物乳杆菌。
菌株 ＨＦ６９过氧化氢酶反应阴性，兼性厌氧，发
酵葡萄糖不产气，能够在１０℃和４５℃下生长。能发
酵核糖、乳糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、甘露
醇、山梨醇、纤维二糖、松三糖、蜜二糖、苦杏仁甙等，
不能发酵棉籽糖，符合乳酸乳球菌乳酸亚种（Ｌａｃｔｏ－
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）的特征，初步确定 ＨＦ６９
为乳酸乳球菌乳酸亚种。
２．２ 分离菌株１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析
菌株 ＨＦ８４，ＨＦ６９和 ＨＦ４９经ＰＣＲ扩增所获
得的１６ＳｒＲＮＡ基因部分序列长度分别为１４６５ｂｐ，
１４５０ｂｐ和１４７５ｂｐ，在ＧｅｎＢａｎｋ中进行１６ＳｒＲＮＡ
基因同源性序列比对，结果显示菌株 ＨＦ８４与多株
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ菌株的１６ＳｒＲＮＡ 基因序列
相似性均达９８％；菌株 ＨＦ６９与Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ菌株的１６ＳｒＲＮＡ基因序列相似性也
达９９％；菌株 ＨＦ４９与多株 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａ－
ｒｕｍ 菌株的１６ＳｒＲＮＡ 基因序列相似性也均达
９９％，利用 ＭＥＧＡ ４．０软件将分离菌株与部分参考
菌株（表３）基于１６ＳｒＲＮＡ基因序列构建系统进化
树（图１），结合菌株形态学及生化特性，将菌株
ＨＦ８４，ＨＦ６９和 ＨＦ４９分别鉴定为蒙氏肠球菌、乳
酸乳球菌乳酸亚种和植物乳杆菌。
表３ 用于构建系统进化树的乳酸菌参考菌株
Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ
ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ
参考菌株
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株号
Ｓｔｒａｉｎｓ Ｎｏ．
ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．
Ｅ．ｍｕｎｄｔｉｉ蒙氏肠球菌 ＬＭＧ １０７４８ ＡＪ３０１８３６
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ 植物乳杆菌 ＪＣＭ １１４９ ＨＭ１６２４１７
Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ布氏乳杆菌 ＤＳＭ ２００５７ Ｍ５８８１１
Ｌ．ｃａｓｅｉ干酪乳杆菌 ＡＴＣＣ ３９３ ＡＦ４６９１７２
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ乳酸乳球菌乳酸亚种 ＮＣＤＯ ６０４Ｔ ＡＢ１００８０３
Ｗ．ｃｏｎｆｕｓａ融合魏斯氏菌 ＪＣＭ １０９３ ＡＢ０２３２４１
Ｗ．ｋａｎｄｌｅｒｉ坎氏魏斯氏菌 ＮＲＩＣ １６２８ ＡＢ０２２９２２
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ枯草芽孢杆菌 ＮＣＤＯ １７６９ Ｘ６０６４６
８６１
第１期 司丙文等：山竹岩黄芪青贮中优质乳酸菌的分离和鉴定
图１ 基于１６ＳｒＲＮＡ基因序列建立的乳酸菌系统进化树
Ｆｉｇ．１ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ １６ＳｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ
２．３ 乳酸菌产酸能力比较
由图２可知，３株乳酸菌在０～６ｈ的产酸速率
较快，至６～１２ｈ时逐渐变缓。在发酵１２ｈ后３株
菌的ｐＨ 值分别达到５．０４，４．７０和４．２０。ＨＦ６９和
ＨＦ４９产酸能力较好，其中 ＨＦ４９的ｐＨ 值最低，产
酸能力最强。
图２ 乳酸菌的产酸速率曲线
Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ
ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ
２．４ 乳酸菌生长曲线的测定
由图３可知，３株乳酸菌生长迅速，在２ｈ时开
始进入对数生长期，ＨＦ６９在６ｈ左右进入稳定期。
ＨＦ８４和 ＨＦ４９在１０ｈ左右进入稳定期，此后的
ＯＤ值变化较小，培养到３６ｈ未见到衰退期。３株
乳酸菌在发酵３６ｈ的ＯＤ值分别为２．０７，１．５８和
３．０１，ＨＦ４９的生长速度最快。这说明３株乳酸菌
在 ＭＲＳ液体培养基中０～１０ｈ的代谢活动非常快，
细胞数量迅速增长，进入稳定期直到３６ｈＯＤ值基
本保持不变，说明乳酸菌达到稳定期后可以稳定存
在于介质中。
３ 讨论
在自然界，植物表面附生的乳酸菌数量很少，
图３ 乳酸菌的生长曲线
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ
一般未达到良好发酵所需的１０５ ｃｆｕ·ｇ－１ ＦＭ 的最
低水平［１０］，在青贮过程中不易成为优势菌群，因此
分离青贮饲料中优质乳酸菌显得尤为重要。本试验
中，从山竹岩黄芪青贮中分离到３株乳酸菌，经传统
鉴定方法及１６ＳｒＲＮＡ序列分析，ＨＦ８４为蒙氏肠
球菌，ＨＦ６９为乳酸乳球菌乳酸亚种，ＨＦ４９为植物
乳杆菌。
用于青贮菌剂的乳酸菌必须具有耐酸性，不仅
要在青贮中可以迅速繁殖，快速降低ｐＨ值，抑制不
良微生物繁殖，还必须可以广泛利用各种可溶性糖，
在较大的温度范围内以及多种条件下均可以生
长［１１］。产酸速度是乳酸菌活力良好的重要特征之
一，不同菌株的产酸速度存在较大的差异。株菌
ＨＦ８４，ＨＦ６９和 ＨＦ４９在发酵１２ｈ后的ｐＨ值分别
为５．０４，４．７０和４．２０，产酸能力最强的是植物乳杆
菌 ＨＦ４９，３株菌在发酵３６ｈ后的 ＯＤ 值分别为
２．０７，１．５８和３．０１，生长速度最快的也是植物乳杆
菌 ＨＦ４９。综合２项指标，３株乳酸菌中植物乳杆菌
ＨＦ４９最适合做青贮饲料乳酸菌添加剂菌种。许多
商业接种菌都选用同型发酵乳酸菌，这些菌株能产
生更多乳酸，快速降低ｐＨ 值，减少营养成分损失，
乳酸杆菌是研究最多的，常用的有植物乳杆菌、干酪
９６１
草 地 学 报 第２０卷
乳杆菌（Ｌ．ｃａｓｅｉ）和戊糖乳杆菌（Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ）等。
Ｗｏｏｌｆｏｒｄ［１２］等经过研究也认为，青贮乳酸菌添加剂
菌种首选植物乳杆菌，并且该菌株在青贮饲料中易
于分离。实际应用情况表明，不同乳酸菌菌株在青
贮中所起的作用不同，单独使用一种菌有时并不能
达到让人满意的青贮效果，乳酸菌青贮添加剂通常
都是植物乳杆菌和其他菌种结合组成的混合物［１３］，
一般情况下选用乳酸球菌，因其在发酵初期繁殖旺
盛，往往做为发酵的启动菌株，乳酸杆菌能发酵很长
时间，在发酵的整个过程中起到了主导作用。近年
来的研究表明［１４～１６］，同型发酵乳酸菌与异型发酵乳
酸菌混合使用更有利于养分保存和有氧条件下品质
稳定，虽然异型发酵乳酸菌乳酸转化效率不如同型
发酵乳酸菌，但异型发酵时产生大量乙酸，乙酸具有
抗真菌的作用，对防止有氧腐败至关重要。
４ 结论
从山竹岩黄芪青贮饲料中分离出３株乳酸菌，
经传统鉴定方法及 １６ＳｒＲＮＡ 序列分析，菌株
ＨＦ８４为蒙氏肠球菌，菌株 ＨＦ６９为乳酸乳球菌乳
酸亚种，菌株 ＨＦ４９为植物乳杆菌。其中植物乳杆
菌 ＨＦ４９产酸能力最强，生长速度最快，特性优良，
适宜做青贮饲料乳酸菌添加剂菌种。
分离出的３株乳酸菌均为同型发酵乳酸菌，乳
酸乳球菌乳酸亚种在５℃、ｐＨ ３．０及６．５％ＮａＣｌ溶
液中不能生长，蒙氏肠球菌在ｐＨ ３．０条件下不能
生长，植物乳杆菌均可在试验设定条件下生长。
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（责任编辑 李美娟）
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