全 文 ：第１９卷 第６期
Ｖｏｌ．１９ Ｎｏ．６
草 地 学 报
ＡＣＴＡ ＡＧＲＥＳＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
２０１１年 １１月
Ｎｏｖ． ２０１１
光周期与温度对紫花苜蓿ｐｈｙＡ
和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达的影响
樊文娜，严学兵，史莹华，王成章＊
（河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州４５０００２）
摘要：通过探讨不同温度和不同光周期对紫花苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ含量的影响，以期为
揭示调控苜蓿秋眠性的分子机理提供科学依据。试验采用ＦＱ－ＰＣＲ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｉ方法，测定了每天８，１２和１６ｈ
光照处理条件下３种秋眠类型苜蓿 ＷＬ－２３２（秋眠型，ＦＤ２）、ＡｒｃｈｅｒⅡ（半秋眠型，ＦＤ５）、ＷＬ－５２５（非秋眠型，ＦＤ８）
的ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达水平；采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ，测定了５℃，１５℃，２５℃和３５℃条件下秋眠型苜蓿Ｖｅｒｎａｌ
（ＦＤ２）的ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达水平。结果表明：苜蓿存在光周期效应，短日照条件下秋眠型苜蓿ｐｈｙＢ ｍＲ－
ＮＡ表达量最大，相同光照条件下不同秋眠型苜蓿的表达规律为秋眠型＞半秋眠型＞非秋眠型，且相对于ｐｈｙＡ，在
紫花苜蓿绿叶中ｐｈｙＢ对光周期的变化反应更敏感。在不同温度条件下秋眠型苜蓿 Ｖｅｒｎａｌ的ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ合成
规律不一致，低温条件下，ｐｈｙＢ表达量较高，ｐｈｙＡ表达量较低；高温条件下，ｐｈｙＡ表达量较高，ｐｈｙＢ表达量较低。
上述结果表明ｐｈｙＢ在调控苜蓿秋眠中发挥了更重要的作用。
关键词：光周期；温度；苜蓿；ｐｈｙＡ；ｐｈｙＢ；ｍＲＮＡ表达
中图分类号：Ｑ９４５．４３；Ｓ５４１．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－０４３５（２０１１）０６－０９７５－０８
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｐｈｙＡ
ａｎｄ ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｆａｌｆａ
ＦＡＮ Ｗｅｎ－Ｎａ，ＹＡＮ Ｘｕｅ－Ｂｉｎｇ，ＳＨＩ Ｙｉｎｇ－Ｈｕａ，ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ－Ｚｈａｎｇ＊
（Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｆａｌ ｄｏｒｍａｎｃｙ ｏｆ ａｌｆａｌｆａ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ
ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｐｈｙＡ ａｎｄ ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔｓ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｐｈｙＡ ａｎｄ ｐｈｙＢ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ
ｔｈｒｅｅ ａｌｆａｌｆａ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ：ｆａｌ－ｄｏｒｍａｎｔ ｖａｒｉｅｔｙ ＷＬ－２３２（ＦＤ２）；ｓｅｍｉ－ｄｏｒｍａｎｔ ＡｒｃｈｅｒⅡ（ＦＤ５）；ａｎｄ ｎｏｎ－ｆａｌ－
ｄｏｒｍａｎｔ ＷＬ－５２５（ＦＤ８）ｕｎｄｅｒ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄａｙ ｌｅｎｇｔｈｓ，（８，１２ａｎｄ １６ｈ）ｂｙ ＦＱ－ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ
Ｉ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｐｈｙＡ ａｎｄ ｐｈｙＢ ｉｎ Ｖｅｒｎａｌ ｖａｒｉｅｔｙ（ＦＤ２）ｕｎｄｅｒ ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ（５，
１５，２５ａｎｄ ３５℃）ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＷＬ－２３２
ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙＡ ａｎｄ ｐｈｙＢ ａｔ ８ｈｄａｙ ｌｅｎｇｔｈ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＷＬ－２３２ｖａ－
ｒｉｅｔｙ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＡｒｃｈｅｒⅡａｎｄ ＷＬ－５２５．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｈｙＡ ａｎｄ ｐｈｙＢ ｖａｒｉｅｄ
ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．Ｔｈｅ ｐｈｙＢ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｐｈｙＡ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｗｈｉｌｅ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｕｎｄｅｒ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｐｈｙＢ ｐｌａｙｅｄ ａ ｍｏｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｔｈａｎ
ｐｈｙＡ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｆａｌｆａ ｄｏｒｍａｎｃｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ；Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ａｌｆａｌｆａ；ｐｈｙＡ；ｐｈｙＢ；ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
光照和温度是调节植物生长的主要环境因素。
紫花苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）是长日照植物，秋冬短
日照下休眠，说明其秋眠（ｆａｌ ｄｏｒｍａｎａｃｙ，ＦＤ）存在
着光周期效应［１，２］。已经证明不同苜蓿品种对低温
和短日照的反应有差异，据此可将其分为秋眠型
（ｆａｌ ｄｏｒｍａｎａｃｙ，１～３级）、半秋眠型（ｓｅｍｉ－ｆａｌ ｄｏｒ－
ｍａｎｃｙ，４～６级）和非秋眠型（ｎｏｎ－ｆａｌ ｄｏｒｍａｎｃｙ，７
～９级）３种类型［３］。Ｂｕｔｌｅｒ［４］等１９５９年研究发现，
植物感受和测量日照长短是通过叶片中的光敏色素
完成的，双子叶植物中至少存在５种不同的光敏色
收稿日期：２０１１－０７－０７；修回日期：２０１１－０８－２３
基金项目：国家牧草产业技术体系建设项目（ＣＡＲＳ－３５）资助
作者简介：樊文娜（１９８１－），女，河南许昌人，助研，硕士，主要从事牧草栽培生理研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｏｕ０５１６＠１６３．ｃｏｍ；＊通信作者 Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ
ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｃｈｅｎｇｚｈａｎｇ＠２６３．ｎｅｔ
草 地 学 报 第１９卷
素基因，即ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ａ（ｐｈｙＡ），ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂ
（ｐｈｙＢ），ｐｈｙＣ，ｐｈｙＤ和ｐｈｙＥ。研究拟南芥（Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）中光敏色素家族基因功能的结果
表明：ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ是在正常光照条件下表现最突
出的２种光敏色素基因［５］，而ｐｈｙＤ与ｐｈｙＥ，ｐｈｙＣ
与ｐｈｙＢ在功能上有重叠［６，７］。研究发现，日照长度
的变化通过ｐｈｙＡ的表达来实现调控植物的开花和
休眠［８］，ｐｈｙＢ作为绿色植物主要光受体通过光周
期调控或参与苜蓿的秋眠［９］，且光反应通过光敏色
素影响了温度反应［１０～１２］，温度反应通过ＦＴ基因直
接影响ｐｈｙＢ来调控开花时间［１１］。光敏色素与光
照、温度之间存在着复杂的反应，为研究苜蓿的秋眠
性和光周期、温度的关系，本试验测定了不同光周期
和不同温度条件下苜蓿的ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达
水平，为揭示其对苜蓿秋眠性的调控机理提供科学
依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验设计
光周期试验：采用２因子３水平设计，采用荧光
定量ＰＣＲ来测定ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达量，参试
的３种秋眠类型紫花苜蓿品种为：秋眠型品种 ＷＬ－
２３２（ＦＤ２），半秋眠型品种ＡｒｃｈｅｒⅡ（ＦＤ５），非秋眠
型品种 ＷＬ－５２５（ＦＤ８）。盆栽，２５℃，设每天８ｈ
（ｓｈｏｒｔ ｄａｙ，ＳＤ）、１２ｈ （ｍｉｄｄｌｅ ｄａｙ，ＭＤ）和１６ｈ
（ｌｏｎｇ ｄａｙ，ＬＤ）３个不同的光照时间处理。试验期
３０ｄ，每处理重复３次，每重复１盆，每盆６株。
温度试验：采用 ＲＴ－ＰＣＲ来测定ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ
ｍＲＮＡ表达量，实验室盆栽，参试苜蓿品种为 Ｖｅｒ－
ｎａｌ（ＦＤ２），每天８ｈ光照，设５℃，１５℃，２５℃，３５℃
共４个温度梯度。试验期３０ｄ，每处理重复３次，每
重复１盆，４×１试验设计。
１．２ 试验材料及试剂
光周期试验：所用材料为大田生长４个月的植
株，移栽入花盆后直接放入ＥＰＱ人工气候箱进行处
理，温度为２５℃，光照强度５０００ｌｘ，湿度５０％～
６０％，定时浇水。植株在光周期处理３０ｄ时，随机
摘取各植株的顶芽和上部叶片，液氮中研磨后，
－８０℃冰箱中保存待用。
温度试验：采用大田生长期为４个月的秋眠型
苜蓿Ｖｅｒｎａｌ植株，除温度设为不同处理外，仪器、试
验条件及取样同上。
１．３ ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ引物设计
光周期试验中，通过荧光ＰＣＲ试验测定 ｍＲ－
ＮＡ表达量３个基因的引物，参考本实验室［１３］提供
的肌动蛋白基因Ａｃｔｉｎ和ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ 的基因全
长［１４，１５］，设 计 引 物 如 下：引 物 Ａｃｔｉｎ：５′－ＧＣ－
ＣＧＡＣＣＴＣＧＴＣＡＴＡＣＴＧＧＴ－３′，５′－ＴＣＴＴＴＴＧＧＡＴ－
ＴＧＧＧＣＴＴＣＧＴ－３′，扩增产物的长度为８０ｂｐ；引物
Ａ：５′－ＴＧＡＣＡＡＡＣＴＡＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧ－３′，５′－
ＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡ－３′，扩增产物
的长度为 ８２ｂｐ；引 物 Ｂ：５′－ＧＣＴＴＧＴＧＣＡＧＣ－
ＣＡＧＴＴＴＧＴＴＴ－３′，５′－ＣＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＴ－
ＴＣＡＴＣ－３′，扩增产物的长度为１４６ｂｐ。
温度试验：Ａｃｔｉｎ引物使用参考［１３］，引物 Ａｃ－
ｔｉｎ：５′－ＧＧＣＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣ－３′，
５′－ＣＡＡＴＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧ－３′，扩增
片段的长度为５７２ｂｐ。ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ引物使用本
实验室克隆基因片段设计的引物［１４，１５］，其中：引物
Ａ：５′－ＴＴＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴ－３′，５′－
ＡＧＣＣＴＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＴＧＣ－３′，扩增
产物 的 长 度 为 ５４９ｂｐ；引 物 Ｂ：５′－ＡＧＣＡＡＣＡ
ＴＡＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＴＣ－３′，５′－ＴＴＧＧＴＴＴＧ－
ＣＡＴＴＡＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧ－３′，扩增产物的长度为
４７５ｂｐ。３个基因的ＰＣＲ产物均已进行过克隆测
序、鉴定［１３～１５］。
管家基因在各种组织中恒定表达，因此可作为
标准参照物比较样本来源不同的目的基因表达量的
差异。Ａｃｔｉｎ是管家基因之一，可以作为内标参照，
研究其他基因ｍＲＮＡ丰度变化，本试验采用内参基
因进行ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达量的测定。
１．４ 光周期试验Ａｃｔｉｎ，ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ片段克隆测序
与ＦＱ－ＰＣＲ检测
提取苜蓿中总ＲＮＡ，以此为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ
扩增，扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳鉴定。对目
的片段进行切胶、纯化回收，将３个基因分别与载体
ｐＭＤ１９－Ｔ连接，转化ＴＧ１感受态细胞，蓝白菌落进
行初步筛选，随机挑取白色菌落进行菌液培养，然后
将含ｐＧＭ－Ｔ－Ａｃｔｉｎ，ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ质粒的菌液送宝生
物工程（大连）有限公司进行测序鉴定。
１．５ 总ＲＮＡ提取与检测
试验样品总ＲＮＡ的提取按照ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ说
明书进行，提取的 ＲＮＡ质量由 ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值
或１．０％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。反转录反应
６７９
第６期 樊文娜等：光周期与温度对紫花苜蓿ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达的影响
前，将所有试验样品提取的 ＲＮＡ浓度调为基本
一致。
１．６ Ａｃｔｉｎ，ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ反应条件的优化
光周期试验中，反转录反应液的配制及其反应
条件如下：２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＭｇＳＯ４２μＬ，２×Ｂｃａ １ｓｔ
Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ，ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ０．７５μＬ，ｄＮＴＰ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（各１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）０．５μＬ，ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉ－
ｔｏｒ（４０Ｕ·μＬ
－１）０．２５μＬ，ＢｃａＢＥＳＴ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（２２Ｕ·μＬ
－１）０．５μＬ，Ｒａｎｄｏｍ ９ｍｅｒｓ ０．５μＬ，
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡ ０．５μＬ，１０μＬ 反应体系
ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（２×）１０．０μＬ，ＰＣＲ Ｆｏｒ－
ｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）０．４μＬ，ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）０．４μＬ，ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｄｙｅ（５０×）０．４μＬ，ＤＮＡ模板２．０μＬ，ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ
ｄＨ２Ｏ ６．８μＬ，２０μＬ反应体系。反应参数为９４℃
预变性２ｍｉｎ，９４℃变性１０ｓ，６０℃退火１５ｓ，７２℃延
伸３０ｓ；４０个循环，荧光信号收集设在７２℃（每循环
第３步反应时）；溶解度曲线程序设置默认为：９５℃，
２ｍｉｎ；７２℃，１ｍｉｎ；９５℃，３０ｓ；进步０．５℃·ｓ－１，
３０℃，１ｍｉｎ。在运行之前，调节增益使荧光本底值
≤２０，也可根据试剂的实际情况调整；仪器检测通道
选择设定为Ｆ１（ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ）通道。在每份样
品中检测ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ和Ａｃｔｉｎ基因的ＣＴ值，并进
行３次ＰＣＲ重复，取３次ＰＣＲ ＥＴ值的平均值，根
据标准曲线计算定量结果，计算校正值。
温度试验：反转录反应同上，ＰＣＲ反应条件为：
２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＭｇＳＯ４３μＬ，５×Ｂｃａ ２ｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ８
μＬ，上下游引物各０．５μＬ，ｄＨ２Ｏ ２７．７５μＬ，５０μＬ
反应体系；３个基因ＰＣＲ反应温度均设为９４℃预变
性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸
４５ｓ，３０个循环；７２℃终延伸５ｍｉｎ。
１．７ 试验结果计算
光周期试验：测定ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达
量，选用管家基因Ａｃｔｉｎ为内参，结果以２－△Ｃｔ表示，
其中，△Ｃｔ为：Ｃｔ目的基因－Ｃｔ参比基因［１６］。
温度试验：分别取ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ＰＣＲ产物和
Ａｃｔｉｎ ＰＣＲ产物，ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ５μＬ，用２．５％琼脂
糖凝胶电泳检查，在凝胶成像分析系统（ＡｌｐｈａＩｍ－
ａｇｅｒ）上摄像并 对 电 泳 条 带 进 行 灰 度 分 析，以
ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ ＰＣＲ产物与相应的 Ａｃｔｉｎ ＰＣＲ产物的
ＩＯＤ的比值来表示ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ的表达
量［１７］。
２ 结果与分析
２．１ Ａｃｔｉｎ，ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ片段克隆测序与ＦＱ－ＰＣＲ
检测结果
使用设计的引物得到与预期扩增长度相符的片
段，扩增得到的产物为特异条带，单一清晰，符合荧
光ＰＣＲ对引物长度、特异性的要求，大小与预期８０
ｂｐ，８２ｂｐ和１４６ｂｐ的目的片段相符（图１）。
ＲＴ－ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳：通过测序分析，其结
果与设计引物所用模板序列一致，ＮＣＢＩ中ＢＬＡＳＴ
的结 果 与 蒺 藜 苜 蓿 （Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）的
ＭＴＹＦ９＿ＦＡ＿ＦＢ＿ＦＣ１Ｇ－Ｏ－４基因、紫花苜蓿品种
ＷＬ－５２５ＨＱ 的 ｐｈｙＡ、紫花苜蓿品种 Ｖｅｒｎａｌ的
ｐｈｙＢ基因序列一致，说明由引物得到的 Ａｃｔｉｎ，
ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ的ＲＴ－ＰＣＲ产物与目的基因相符。测
序结果ＮＣＢＩ序列比对表明，序列已正确插入到质
粒载体中（图２～４）。
图１ 紫花苜蓿ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ与Ａｃｔｉｎ 基因片段
ＲＴ－ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳检测图
Ｆｉｇ．１ ＲＴ－ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ａｃｔｉｎ，ｐｈｙＡ ａｎｄ ｐｈｙＢ
ｉｎ ａｌｆａｌｆａ（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
荧光定量ＰＣＲ扩增曲线：由图５和图６可知，
ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ与Ａｃｔｉｎ荧光定量ＰＣＲ扩增曲线的峰
型正常，可用于ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ的相对定量。
２．２ 光周期对不同秋眠类型紫花苜蓿品种ｐｈｙＡ
和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达量的影响
由表１可知，不同的光周期处理对同一个紫花
苜蓿品种ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ相对含量的影响程度有差
异，但无明显的规律性。秋眠２级品种８ｈ和１６ｈ
的ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ相对含量接近，差异不显著，但二
者均显著高于１２ｈ光照处理（Ｐ＜０．０５）；秋眠５级
品种以１２ｈ光照处理ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ相对含量最高，
７７９
草 地 学 报 第１９卷
８ｈ次之，８ｈ和１２ｈ间差异不显著但均显著高于
１６ｈ光照处理（Ｐ＜０．０５）；秋眠８级品种８ｈ光照
处理ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ相对含量显著高于１２ｈ和１６ｈ
光照处理（Ｐ＜０．０５），后二者差异不显著。由此可
知，尽管３个秋眠类型苜蓿品种不同光周期之间
ｐｈｙＡｍＲＮＡ均无明显的规律性，但他们都有在短
８７９
第６期 樊文娜等：光周期与温度对紫花苜蓿ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达的影响
表１ 不同光周期和秋眠类型对紫花苜蓿ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ的表达量
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ ＦＤ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｎ ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ
苜蓿品种Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ８ｈ １２ｈ １６ｈ
秋眠２级 ＷＬ－２３２（ＦＤ２） ０．００３８２±０．０００３６Ａａ ０．００１９８±０．０００４２Ｂｂ ０．００３７２±０．０００２３Ａａ
秋眠５级ＡｒｃｈｅｒⅡ（ＦＤ５） ０．００３６０±０．０００９２Ａａ ０．００４３０±０．０００３８Ａａ ０．０００２２±０．００００５Ｃｂ
秋眠８级 ＷＬ－５２５（ＦＤ８） ０．００４３９±０．０００８５Ａａ ０．０００９５±０．０００２５Ｃｂ ０．０００８０±０．０００３４Ｂｂ
注：同行肩标小写字母不同表示光周期差异显著（Ｐ＜０．０５），同列肩标大写字母不同表示秋眠型差异极显著（Ｐ＜０．０１）；下同
Ｎｏｔｅｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｍａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｉｎｅ ｍｅａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｓ（Ｐ＜０．０５），ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｐｉｔａｌ ｌｅｔ－
ｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｍｅａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＦＤ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ（Ｐ＜０．０１）；ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｂｅｌｏｗ
表２ 不同光周期和秋眠类型对紫花苜蓿ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达量的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ ＦＤ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｎ ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ
苜蓿品种ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ８ｈ １２ｈ １６ｈ
秋眠２级 ＷＬ－２３２（ＦＤ２） ０．９８０１９±０．０４７５５Ａａ ０．９７１７２±０．０８４１１Ａａ ０．２７２５１±０．０２６３２Ａｂ
秋眠５级ＡｒｃｈｅｒⅡ（ＦＤ５） ０．２６１６７±０．０５５８９Ｂｂ ０．４３８３７±０．００９１２Ｂａ ０．００８００±０．００１４８Ｃｃ
秋眠８级 ＷＬ－５２５（ＦＤ８） ０．０２６８７±０．００５４２Ｃｂ ０．０２８１０±０．００２４０Ｃｂ ０．０３８２５±０．００２１１Ｂａ
日照下合成更高量的ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ的趋势。由表１
可知，同一光周期处理对不同秋眠类型品种ｐｈｙＡ
ｍＲＮＡ相对含量的影响也无明显规律性。在８ｈ
光照处理时，３个秋眠类型苜蓿品种ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ
相对含量无显著差异；就１２ｈ光照处理时ｐｈｙＡ
ｍＲＮＡ相对含量来说，秋眠５级品种＞秋眠２级品
种＞秋眠８级品种，且三者之间均差异显著（Ｐ＜
０．０５）；在１６ｈ光照处理时，秋眠２级品种ｐｈｙＡ
ｍＲＮＡ的相对含量最高，依次为秋眠８级品种和秋
眠５级品种，３个品种之间差异显著（Ｐ＜０．０５）。
由表２可知，不同的光周期处理对同一紫花苜
蓿品种的ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ相对含量的影响程度不同。
９７９
草 地 学 报 第１９卷
秋眠２级品种８ｈ和１２ｈ光照处理ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ的
相对含量显著高于１６ｈ光照处理（Ｐ＜０．０５）；秋眠
５级品种１２ｈ光照处理ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ相对含量最
高，８ｈ光照处理次之，１６ｈ光照处理ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ
相对含量最低，三者之间差异显著（Ｐ＜０．０５）；秋眠
８级品种１６ｈ光照处理ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ相对含量显著
高于８ｈ和１２ｈ光照处理（Ｐ＜０．０５）。由以上结果
可知，秋眠２级品种表现为较短光照时间能合成更
高的ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ，秋眠５级品种在中短日照条件
下比长日照能合成较高的ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ，秋眠８级
品种均表现为较长光照时间能合成高含量的ｐｈｙＢ
ｍＲＮＡ。由表２还可看出，在同一光周期条件下，不
同品种的ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ相对含量变化规律趋势明
显。８ｈ和１２ｈ光照处理ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ相对含量均
表现为：秋眠２级品种＞秋眠５级品种＞秋眠８级
品种，且品种之间均差异显著（Ｐ＜０．０５）；１６ｈ光照
处理时，秋眠２级品种的ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ相对含量显
著高于秋眠５级和秋眠８级品种（Ｐ＜０．０５）。
２．３ 不同温度对秋眠型紫花苜蓿ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ ｍＲ－
ＮＡ表达量的影响
由于采用凝胶成像分析系统上摄像并对电泳条
带进行灰度分析，受影响因素较多，不能精确得出
ｍＲＮＡ的相对含量，但能分析出不同温度条件下
ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ的表达趋势（图７）。
图７ ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ＲＴ－ＰＣＲ产物凝胶电泳分析
Ｆｉｇ．７ Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｈｙＡ，ｐｈｙＢ ＲＴ－ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
从Ｖｅｒｎａｌ在不同温度条件下ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ的
表达量来看，在２５℃和３５℃条件下较高，在５℃和
１５℃条件下ｍＲＮＡ表达量相对较少，说明高温有利
于ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ的表达；由图８可知，５℃和１５℃低
温条件下，ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达量较高，２５℃和３５℃
条件下 ｍＲＮＡ表达量相对较少，说明低温有利于
ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ的表达。
图８ 紫花苜蓿ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达相对含量
Ｆｉｇ．８ ｍＲＮＡ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｐｈｙＡ ａｎｄ ｐｈｙＢ ｉｎ ａｌｆａｌｆａ
３ 讨论
在光周期试验中要特别注意对最适引物的筛
选，由于ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光染料为双链ＤＮＡ特异
性染色，它不仅和靶基因的扩增产物结合，也会同非
特异性ＰＣＲ产物结合，从而影响结果判断，故引物
设计及ＰＣＲ条件优化显得尤为重要，要求务必确保
ＰＣＲ扩增产物的条带清晰且单一。荧光定量产物
长度为８０～１５０ｂｐ最好，最长不要超过３００ｂｐ，试
验中３个基因引物的扩增片段均在８０～１５０ｂｐ之
间，凝胶电泳条带清晰且单一，测序结果也很理想；
其扩增出来的３个基因的熔解曲线非常标准，没有
杂峰和引物二聚体的出现，可以进行下一步荧光定
量试验。
秋眠是一种特殊的休眠方式，即内生性休眠。
由于苜蓿的秋眠性与其抗寒性正相关，故多年来有
关苜蓿秋眠性的调控机理研究多集中在不同秋眠类
型苜蓿与抗寒性有关的物质代谢上［１８～２０］，从光周期
尤其是从分子水平研究苜蓿秋眠性调控机理的研究
很少。Ｄａｖｉｄ研究认为，昼夜节律循环（生物钟）、日
照长度、温度通过调控ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ含量、开花相
关基因（ＦＴ，ＣＥＮ，ＡＰ１等）表达量、ＣＯ含量、激素
含量等调控植物的休眠［２１］；Ｋｕｈｎ Ｎ的试验也证明
ｐｈｙＡ 和ｐｈｙＢ 基因的表达受昼夜节律循环调
０８９
第６期 樊文娜等：光周期与温度对紫花苜蓿ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达的影响
控［２２］，昼夜节律功能似乎在板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓ－
ｓｉｍａ）的生态休眠中停止作用，但其相关基因在内生
性休眠和幼苗中却被启动［２３，２４］。相似的现象也发
生在日照长度诱导葡萄叶（Ｖｉｔｉｓ ｓｐｐ．）的休眠中，在
这些试验中，ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ含量在正常生长季节不
稳定，一旦被转移至短日照诱导休眠的条件下，
ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ不稳定的表达现象都停止，取而代之
的是其表达量均出现增加［２２，２５］；Ｍａｚｚｅｌａ和Ｓｅｏ Ｍ
［２６，２７］证明，ｐｈｙＢ直接或间接调控了 ＡＢＡ的合成，
进而影响拟南芥的休眠。
Ｆｒａｎｋｌｉｎ［２８］研究认为，光和温度调节植物生命
循环，在植物生长的过程中具有复杂的互作效应，通
过调节光受体相关基因、激素信号方式来调节生命
体征，以适应自然环境变化。在植物的秋冬季休眠
中，短日照是其主要的调控因子，在杨树（Ｐｏｐｕｌｕｄ
ｓｐ．）、葡萄、狗木（Ｃｏｒｎｕｓ ｓｅｒｉｃｅａ）中均得到了证
实［２９～３１］，并且ｐｈｙＡ表达量的变化可改变其对休眠
诱导光照时间的阈值，在短日照时ｐｈｙＡ的超表达
可抑制休眠诱导，改变其日照长度能改变其休眠反
应［３０～３２］。ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ的表达在光信号通路中发
挥着重要的作用，拟南芥中９６％光诱导的基因是通
过ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ来调节的［３３］；Ｈｅｓｃｈｅｌ［３４］研究发
现，拟南芥在不同温度条件下，发芽需要不同的光敏
色素，在温度较低时，ｐｈｙＥ发挥主要作用；在温度较
高时，ｐｈｙＡ发挥主要作用；在温度变化较大的情况
下，ｐｈｙＢ发挥主要作用。
本试验研究了３个不同秋眠类型苜蓿品种在短
日照（８ｈ）、中日照（１２ｈ）和长日照（１６ｈ）条件下叶
片中的ｐｈｙＡ 与ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ 的表达量。结果表
明，３个不同秋眠类型苜蓿品种在不同的光周期条
件下ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ的表达量均无明显的规律性，但
似乎３个品种均是在８ｈ光照下其合成量高；无论
是８ｈ光照，还是１２ｈ和１６ｈ光照，３个品种之间
的ｐｈｙＡ ｍＲＮＡ 含量均无明显变化规律，说明
ｐｈｙＡ可能和苜蓿的秋眠性无太大关系。从ｐｈｙＢ
ｍＲＮＡ表达量来看，不同光周期之间比较，无论是
秋眠型的２级品种 ＷＬ－２３２还是半秋眠的５级品种
ＡｒｃｈｅｒⅡ均是在８ｈ和１２ｈ光照条件下含量高；同
一个光周期条件下的ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ含量，均呈现出
秋眠２级品种＞半秋眠的５级品种＞非秋眠的８级
品种的趋势，说明ｐｈｙＢ很可能是调控苜蓿秋眠的
主要光受体，在日照较短条件下通过提高秋眠型和
半秋眠型苜蓿品种ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ的合成量从而调控
了这２类苜蓿的秋眠；而在长日照条件下，ｐｈｙＢ
ｍＲＮＡ的合成量小，从而使其秋眠不能表达。ｐｈｙＢ
ｍＲＮＡ合成量与其苜蓿叶片中的ｐｈｙＢ蛋白表达趋
势一致［９］，说明调控苜蓿秋眠在ｐｈｙＢ的转录水平
上进行，与 Ｋｕｈｎ Ｎ在葡萄中的研究结果相似［２２］。
苜蓿为长日照植物，短日照和中日照都为苜蓿生长
创造了较强的逆境效应，苜蓿为应对这种不良的环
境刺激，通过加速ｐｈｙＢ合成，诱导苜蓿进入秋眠，
尤其短日照条件下２级品种即秋眠型苜蓿品种
ｐｈｙＢ表现最为明显，合成量也最大。
本研究温度试验结果表明，ｐｈｙＡ 在２５℃和
３５℃较高温度条件下合成量大于低温条件下的合成
量，而ｐｈｙＢ相反，５℃和１５℃较低温度条件下的合
成量高于２５℃和３５℃较高温度条件下的合成量。
可能ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ与温度、光周期在调控苜蓿秋眠
性上存在互作效应。
４ 结论
４．１ 苜蓿的秋眠存在光周期效应，短日照条件下秋
眠型ｐｈｙＢ ｍＲＮＡ表达量最大，相同光照条件下不
同秋眠型苜蓿的表达规律：秋眠型＞半秋眠型＞非
秋眠型，且相对于ｐｈｙＡ，在紫花苜蓿绿叶中ｐｈｙＢ
对光周期的变化反应更敏感。
４．２ 在不同温度条件下秋眠型苜蓿ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ
合成规律不一致，ｐｈｙＢ在调控苜蓿秋眠中发挥了更
重要的作用，可能光敏色素在温度反应中存在互作
效应，具体机理有待于进一步研究。
４．３ 温度与光周期都参与了对苜蓿秋眠的调控。
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（责任编辑 李美娟）
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