全 文 ：美味牛肝菌胞外多糖的发酵条件研究＊
邓百万　陈文强
(陕西理工学院 陕西省资源生物重点实验室 , 汉中 , 723001)
摘　要　对美味牛肝菌(Boletus edulis Bull)胞外多糖的发酵条件进行了优化筛选。结果表明 ,美味牛肝菌发酵
生产胞外多糖的最适碳源是蔗糖 , 氮源是豆饼粉;液体发酵的优化培养基是马铃薯 10%, 蔗糖 2.0%, 豆饼粉
0.6%, KH2PO 4 0.3%,MgSO4·7H2O 0.2%, CaCO3 0.2%;液体发酵的优化条件是初始 pH 5.4～ 5.8 ,振荡速度
180～ 220 r/min , 培养温度 28℃,装液量 60%(V/ V)。将菌株放大至 7 L 罐发酵培养 , 28℃发酵 90 h , 胞外多糖
得率是 3.284g/ L。
关键词　美味牛肝菌 , 液态发酵 ,胞外多糖
　第一作者:硕士 ,副教授。
＊陕西省教育厅专项科研基金资助项目“食用菌优势栽培技术
研究”(99JK109)部分内容
　收稿日期:2005-04-07 ,改回日期:2005-07-20
　　美味牛肝菌(Boletus edulis)俗称大脚菇 ,菌盖扁
平球形 ,子实体单生或群生 ,常与栎树和松树的树根
形成菌根[ 1] ,是一种优质的食用菌 ,也是一种药用真
菌。据报道 ,美味牛肝菌含有 20多种氨基酸 ,其中有
人体必需的异亮氨酸 、亮氨酸 、苯丙氨酸 、苏氨酸等多
种氨基酸 ,多种维生素和矿物质 、多糖 ,具有协调内分
泌 、神经系统 、提高人体免疫力以及显著的抗癌作
用[ 1 ～ 3] 。该菌子实体的水提取活性物质(多糖),对
小白鼠肉瘤 5-180的抑制率为 100%,对艾氏瘤的抑
制率为 90%[ 4] 。美味牛肝菌为菌根菌 ,目前仍不能
进行人工栽培 ,液体发酵生产胞外多糖也未见报道。
本文对美味牛肝菌液体生产胞外多糖的发酵条件进
行了研究 。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　供试菌种
美味牛肝菌(Boletus eduls)由陕西省资源生物重
点实验室食药用菌种保藏中心提供 。
1.1.2　培养基
母种培养基:CPDA 培养基(马铃薯 20%,葡萄
糖 2%, KH2PO4 0.5%, MgSO4 ·7H2O 0.3%, VB
1
0.001%,琼脂 2%,pH 自然);基础培养基 1:马铃薯
10%,酵母粉 0.2%, KH2PO4 0.3%, MgSO4·7H2O
0.15%,CaCO3 0.2%;基础培养基 2:马铃薯 10%,蔗
糖 2%, KH2PO4 0.3%,MgSO4·7H2O 0.15%,CaCO3
0.2%。
1.2　方　法
1.2.1　菌种活化
配制 CPDA 培养基 ,分装试管 , 121.3℃ 30 min
灭菌 ,放置斜面 ,接种美味牛肝菌母种 ,28℃培养 ,待
菌丝满管后置 4℃保藏备用。
1.2.2　液体种制备
制备液体发酵培养基 , 500 mL 三角瓶装液量
300 mL , 121.3℃ 30 min灭菌 ,接活化菌种 ,在初始
pH 5.4 ～ 6.0 ,振荡速度 180 r/min ,培养温度 28℃条
件下 ,进行液体培养。
1.2.3　7 L 发酵罐的动态发酵试验
7 L 全自动发酵罐 ,pH 、溶氧和温度探头 ,梅特勒
公司;在线自动检测 ,上海保兴生物工程公司。接种
量 10%、搅拌速度 160 ～ 210 r/min 、通风 0.8 vvm 、温
度 26 ～ 28℃、装液量 4.2 L 、罐压 0.48 kg/cm2 。
1.2.4　胞外多糖的提取
收集发酵液 ,3 500 r/min离心 20 min ,收集上清
液 ,浓缩 ,加入 3倍体积的 95%酒精 , 4℃沉淀 48 h ,
3 500 r/min离心 20 min ,收集粗多糖 ,烘干测定。
1.2.5　菌丝干重测定
发酵后的菌丝体经离心过滤并用纯净水冲洗 3
次 ,再用滤纸吸至不滴水 ,用电子天平称重。
1.2.6　多糖的测定
采用苯酚-硫酸法[ 5] 。
1.3　主要仪器
BIOTECH-7BGZ 全自动机械搅拌玻璃发酵罐 ,
THZ-82A 型恒温旋转摇床 , HANGPINGFA-1604 型
电子天平 ,人工气候箱 ,800型医用离心机等 。
2　结果与分析
2.1　发酵培养基的筛选试验
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTAT ION INDUSTRIES
60　 2005 Vol.31 No.9(Total 213)
DOI :10.13995/j .cnki.11-1802/ts.2005.09.017
2.1.1　不同碳源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响
在基础培养基 1 中 ,以 0.2%酵母粉为氮源 ,分
别以 2%的葡萄糖 、乳糖 、蜂蜜 、蔗糖 ,麦芽糖为碳源
进行多糖发酵试验 ,每种处理重复 6次 ,测定不同碳
源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响 ,见表 1。
表 1　不同碳源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响　g/ L
碳　源 葡萄糖 乳糖 蜂蜜 蔗糖 麦芽糖
胞外多糖 1.632 1.173 2.097 1.838 1.903
　　表 1结果表明 ,以蜂蜜 、麦芽糖作为碳源时 ,胞外
多糖得率最高 ,分别为 2.097g/L 和 1.903g/ L。蔗
糖 、葡萄糖次之 ,乳糖胞外多糖得率最低 。考虑到规
模化生产过程中原料的易得性及经济因素 ,确定蔗糖
为最佳碳源。但以蔗糖为单一碳源时 ,其菌体易结菌
丝球 ,且结构较紧密 ,影响菌体生长和物质交换。因
此 ,向培养基中添加 10%马铃薯可改善菌丝球的生
长 ,菌丝球体积明显变小 ,也有利于菌丝体生长和代
谢过程中的物质交换 。
2.1.2　不同氮源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响
在基础培养基 2 中 ,以 2%蔗糖为碳源 ,分别以
0.2%蛋白胨 、0.4%豆饼粉 、0.4%麸皮 、0.2%酵母
粉 ,0.2%水解乳蛋白为氮源进行多糖发酵试验 ,每组
处理重复 6次 ,测定不同氮源对美味牛肝菌胞外多糖
得率的影响 ,见表 2。
表 2　不同氮源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响　g/ L
氮源 蛋白胨 豆饼粉 麸皮 酵母粉 水解乳蛋白
胞外多糖 2.306 3.705 1.484 1.531 0.983
　　表 2结果表明 ,以豆饼粉和蛋白胨作为氮源时 ,
胞外多糖得率最高 ,分别为 3.705 g/ L和 2.306 g/L。
酵母粉 、麸皮次之 ,水解乳蛋白胞外多糖得率最低 ,仅
为 0.983 g/L。综合考虑确定豆饼粉为最佳氮源 。
2.1.3　培养基成分优化试验
以蔗糖为碳源 ,豆饼粉为氮源 , 添加 10%马铃
薯 、KH2PO4 、MgSO4·7H2O ,进行 L9(34)正交试验 ,如
表 3所示 ,结果见表 4 。
表 3　正交试验因子及水平安排
因子 蔗糖
A
豆饼粉
B
KH2PO 4
C
MgSO 4·7H2O
D
水平 1 1.0 0.4 0.1 0.1
水平 2 2.0 0.5 0.2 0.15
水平 3 3.0 0.6 0.3 0.2
　　试验结果根据极差分析 ,影响美味牛肝菌胞外多
糖得率的大小关系分别为 C>B>A>D。各因子的
最佳水平组合是 A2B3C1D3 。因此确定美味牛肝菌液
体发酵生产胞外多糖的培养基配方是马铃薯 10%,
蔗糖 2%, 豆饼粉 0.6%, KH2PO4 0.3%, MgSO4·
7H2O 0.2%,CaCO3 0.2%。
表 4　正交试验方差分析
试验号 A B C D 粗多糖含量/ g·L -1
1 1.0 0.4 0.1 0.1 0.925
2 1.0 0.5 0.2 0.2 0.901
3 1.0 0.6 0.3 0.3 1.068
4 2.0 0.4 0.2 0.3 0.568
5 2.0 0.5 0.3 0.1 0.942
6 2.0 0.6 0.1 0.2 2.872
7 3.0 0.4 0.3 0.2 0.365
8 3.0 0.5 0.1 0.3 2.575
9 3.0 0.6 0.2 0.1 0.793
k 1 2.894 1.585 6.372 2.660
k 2 4.382 4.418 2.262 4.138
k 3 3.733 4.733 2.375 4.211
2.2　发酵条件优化试验
2.2.1　初始 pH对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响
将培养液初始 pH 分别调为 4.8 、 5.0 、 5.2 、
5.4 、 5.6 、 5.8 、 6.0 、 6.2 ,接活化后的斜面菌种 1.0
cm2 ,静置培养24 h ,28 ℃,180 r/min , 500 mL 三角瓶
装液量 300 mL ,振荡培养 7 d。测定 pH 对美味牛肝
菌胞外多糖得率的影响 ,见表 4。
表 4　pH对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响　g/ L
pH 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2
胞外多糖 1.513 1.715 1.410 2.120 2.278 2.553 1.912 1.720
　　表 4结果表明 ,在 pH <5.2和 pH >6.0时 ,美味
牛肝菌胞外多糖得率呈下降趋势。在 pH5.4 ～ 5.8
之间 ,美味牛肝菌胞外多糖得率维持在较高水平。因
此 ,美味牛肝菌液体发酵生产胞外多糖的最适 pH 范
围是 pH 5.4 ～ 5.8。
2.2.2　培养温度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响
选择 18 、20 、22 、24 、26 、28 、30 、32℃发酵温度 ,接
活化后的斜面菌种 1.0 cm2 , 静置培养 24 h ,在 pH
5.8 ,180 r/min ,500 mL 三角瓶装液量 300 mL ,振荡
培养 7d。测定培养温度对美味牛肝菌胞外多糖得率
的影响 ,见表 5。
表 5　培养温度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响　g/ L
温度/ ℃ 18 20 22 24 26 28 30 32
胞外多糖 1.123 1.489 2.476 2.873 2.987 3.134 2.389 0.863
　　表 5结果表明 ,不同温度对美味牛肝菌胞外多糖
得率有明显的影响 ,胞外多糖得率在一定范围内随着
温度的升高而增长 , 28℃时胞外多糖得率达最高 ,为
3.134 g/L 。超过 30℃胞外多糖得率明显下降 。因
此 ,美味牛肝菌液体发酵生产胞外多糖的最适温度是
28℃。
生产与科研经验
2005年第 31卷第 9期(总第 213期) 61　
2.2.3　振荡速度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响
选择 100 、120 、140 、160 、180 、200 、220 、240 r/min
不同振荡速度 ,接活化后的斜面菌种 1.0 cm2 ,静置
培养 24 h ,在 28℃, pH5.8 , 500 mL 三角瓶装液量
300 mL ,振荡培养 7 d。测定振荡速度对美味牛肝菌
胞外多糖得率的影响 ,见表 6。
表 6　振荡速度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响　g/ L
振荡速度
/ r·min-1 100 120 140 160 180 200 220 240
胞外多糖 1.472 1.864 2.369 2.876 3.187 3.492 3.684 3.686
　　表 6结果表明 ,不同振荡速度对美味牛肝菌胞外
多糖得率有明显的影响。随着振荡速度的升高 ,美味
牛肝菌胞外多糖得率增加明显。在振荡速度<160
r/min和>200 r/min 时 ,美味牛肝菌胞外多糖得率
增加幅度较小。因此 ,美味牛肝菌液体发酵生产胞外
多糖的最适振荡速度范围是 180 ～ 220 r/min 。
2.3　7 L发酵罐中美味牛肝菌胞外多糖发酵动态试
验
在 7 L 发酵罐中扩大培养 ,前 48 h 内每隔 12 h
取样 ,测定溶氧 、菌丝干重和多糖含量 ,然后每隔 6 h
取样测定结果。美味牛肝菌发酵过程中溶氧 、 pH 、
菌丝干重与胞外多糖得率的动态试验结果见表 7。
表 7　7 L发酵罐中美味牛肝菌胞外多糖发酵动态试验
发酵时间/ h 24 36 48 54 60 66 72 78 84 90 96
溶氧/ % 88 61 43 36 28 18 16 7 1.6 1 0.4
pH 5.61 5.48 5.27 5.16 4.88 4.83 4.60 4.63 4.71 4.78 4.90
菌丝干重/ g·L -1 1.16 3.94 5.73 11.32 16.38 19.27 23.17 23.49 23.58 23.64 23.62
胞外多糖/ g·L -1 0.32 0.48 1.29 1.87 2.28 2.73 2.98 3.13 3.21 3.28 3.17
　　表 7结果表明 ,美味牛肝菌发酵 24 h 后 ,溶氧明
显下降 ,菌丝体开始进入对数生长期 ,胞外多糖得率
增加缓慢;发酵 48 h ,溶氧持续下降 ,菌丝体增长较
快 ,胞外多糖得率增加明显;发酵至 60 h ,溶氧维持在
较低水平 ,菌丝体大量生长 ,菌体代谢旺盛 ,培养液变
粘稠 ,胞外多糖得率持续增加;发酵至90 h ,溶氧几乎
达到最低 , 菌丝体增长不明显 , 胞外多糖得率达
3.284 g/L;继续进行发酵 ,胞外多糖得率保持在较高
水平 ,维持 4h 左右开始下降 ,并一直持续到发酵结
束。根据振荡速度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影
响 ,可通过提高转速和加大通风量来改善溶氧水平。
随着发酵时间的延长 ,pH 持续下降 ,到 72h降到最低
4.60 ,82 h 后开始缓慢回升 , 至发酵结束终止 pH
4.90 。
3　结　论
(1)正交实验确定的美味牛肝菌液体发酵生产胞
外多糖的最适培养基配方是马铃薯 10%,蔗糖 2%,
豆饼粉 0.6%, KH2PO4 0.3%, MgSO4·7H2O 0.2%,
CaCO3 0.2%;美味牛肝菌液体发酵生产胞外多糖的
最适发酵条件是起始 pH 5.4 ～ 5.8 ,培养温度 28℃,
振荡速度 180 ～ 220 r/min ,装液量 60%(V/V)。
(2)试验证明 pH 是影响产生多糖的一个重要因
素 ,美味牛肝菌产多糖的最适起始 pH 是 5.4 ～ 5.8。
这与李平作等[ 6]在研究灵芝产胞外多糖的最适起始
pH为 5.5的结论是基本一致的;另外 ,氧气也是影响
多糖产生的另一重要因素 ,美味牛肝菌发酵过程中 ,
创造有利于氧气溶解的条件 ,胞外多糖的产量要高 ,
这说明溶氧量大 ,有利于多糖的产生。因此 ,在发酵
过程中采取措施满足要求 ,将会产生更大的效益。
(3)美味牛肝菌经 7L 发酵罐扩大培养 , 28℃液
体发酵培养 90h ,胞外多糖得率达 3.284 g/ L。在获
得胞外多糖的同时 , 可获得 23.64 g/L 菌丝体(干
重),美味牛肝菌深层培养的菌丝体主要营养成分质
量普遍高于野生子实体 ,胞内粗多糖占菌丝体质量的
10.62%[ 7] 。由于美味牛肝菌尚未实现人工栽培 ,而
液体发酵培养仅需 90 h ,可获得大量的菌丝体 ,产量
高 ,成本低 ,周期短 ,具有显著优势 ,因此 ,通过深层发
酵解决美味牛肝菌野生资源不足之矛盾 ,满足人们对
蛋白食品和营养保健品日益增长的需求 。
参 考 文 献
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2　王允祥 ,陆兆新 , 吕凤霞 ,等.牛肝菌胞外多糖发酵培养基
的优化[ J] .食品与发酵工业 , 2004 , 30(6):71～ 77.
3　王允祥 ,陆兆新 , 吕凤霞 , 等.牛肝菌摇瓶发酵条件优化研
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180肿瘤的效应[ J] .西南师范大学学报(自然科学版),
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5　中山大学生物系生化微生物教研室编.生化技术导论
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6　李平作 ,章克昌.灵芝胞外生物活性多糖的 pH 控制发酵
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7　邓百万 ,陈文强.美味牛肝菌深层发酵条件的优化及成分
分析[ J].无锡轻工大学学报 , 2004 , 23(6):96 ～ 99
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTAT ION INDUSTRIES
62　 2005 Vol.31 No.9(Total 213)