全 文 ：249※营养卫生 食品科学 2009, Vol. 30, No. 05
杏仁蛋白水解物对血管紧张素转化酶抑制
作用的研究
刘 宁，仇农学*，朱振宝，牛鹏飞，王丽媛，苗利利
(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062)
摘 要：分别采用Protamex、Alcalase、Neutrase、Flavourzyme、Prol ather FG-F、木瓜蛋白酶水解杏仁蛋白，
利用高效液相色谱法测定水解物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制活性，以水解度(DH)和水解产物对ACE的抑制率
为指标对酶解过程进行分析，并研究水解物的体外消化稳定性。结果表明，Proleather FG-F和Alcalase对杏仁蛋
白有较好的水解效果，其水解物对ACE抑制率较高，IC50分别为1.24mg/ml和0.98mg/ml。模拟胃肠消化实验结果
表明，在消化酶的作用下杏仁蛋白水解物仍具有较强的ACE抑制活性。
关键词：杏仁蛋白；ACE抑制活性；水解度；模拟胃肠消化
Inhibitory Effects of Almond Protein Hydrolysate against AngiotensinⅠ-c nverting Enzyme
LIU Ning，QIU Nong-xue*，ZHU Zhen-bao，NIU Peng-fei，WANG Li-yuan，MIAO Li-li
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)
Abstract ：Almond protein was respectively hydrolyzed with Protamex, Alcalase, Neutrase, Flavourzyme, Proleather FG-F
and Papain, and then the angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitories activities of obtained hydrolysates were detected
by high performance liquid chromatography (HPLC). With the degree of hydrolysis (DH) and the ACE-inhibitory activity of
hydrolysate as evaluation indexes, the hydrolysis course and the digestion stability in vitroof the hydrolysate were s udied. The
results indicated that Proleather FG-F and Alcalase have better hydrolysis ability to almond protein than other proteases, and
the IC50 values of their hydrolysates to ACE are 1.24 mg/ml and 0.98 mg/ml, respectively. Moreover, after simulated
gastrointestinal digestion their hydrolysates still have high ACE-inhibitory activity.
Key words：almond protein；ACE-inhibitory activity；degree of hydrolysis；simulated gastrointestinal digestion
中图分类号：TS202.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)05-0249-04
收稿日期：2008-04-02
作者简介：刘宁(1984-)，男，硕士研究生，研究方向为食品分离技术。E-mail：lynn20020226@stu.snnu.edu.cn
*通讯作者：仇农学(1945-)，男，教授，研究方向为食品分离与现代果汁加工技术。E-mail：nongxueq@snnu.edu.cn
据报道，我国高血压患者已超过1亿人，预防和
治疗高血压病是当今社会十分重要的课题[1]。血管紧张
素转化酶(Angiotensin Ⅰ-Converting Enzyme，ACE)在
血压调节中起着重要作用。目前用于降血压的药物，其
降压原理主要是抑制ACE的活性[2]。
近年来，国内外对天然ACE抑制剂的研究报道较
多，目前已经从多种动植物原料及下脚料中分离出多种
降血压肽，采用的工艺技术主要包括从发酵食品中分离
提取、从自溶产物中提取以及从蛋白水解物中提取等[3]。
已有报道利用酪蛋白、大豆蛋白、鱼贝蛋白、小麦胚
芽蛋白、玉米蛋白、花生蛋白等[4-10]制备降血压肽。
杏仁是蔷薇科李属植物——杏(Prunus armeniaca L.)
的种子，脱苦、脱甙的杏仁是一类优质的植物蛋白资
源，其氨基酸组成平衡合理，营养价值较高[11]，目前
国内外对杏仁蛋白水解物对抗ACE活性的抑制作用的研
究还未见报道。本研究以杏仁蛋白粉为原料，分别用
Protamex、Alcalase、Neutrase、Flavourzyme、
Proleather FG-F、木瓜蛋白酶对其进行水解，研究水解
过程中水解度的变化，对水解产物的ACE抑制效果及体
外消化稳定性进行探讨，以期为杏仁蛋白的深度开发及
降血压肽的研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
杏仁蛋白粉为实验室自制。
血管紧张素转化酶和马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-
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His-Leu，HHL) 美国Sigma公司；复合蛋白酶
(Protamex)、碱性蛋白酶(Alcalase)、中性蛋白酶
(Neutrase)和风味蛋白酶(Flavourzyme) 丹麦诺维信(Novo)
公司；碱性蛋白酶(Proleather FG-F) 日本天野酶制品株
式会社；木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶 和马尿酸
(hippuric acid) 西安盛泰生物科技有限公司；其他试剂
均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
高效液相色谱仪 美国Dinex公司；501A型超级恒
温水浴槽 上海实验仪器厂有限公司；TGL-16G型高速
离心机 上海安亭科学仪器厂；LGJ-10型冷冻干燥机 巩
义予华仪器有限责任公司；PHS-3C型精密pH计 上海
精密科学仪器有限公司； SZ-93型自动双重纯水蒸馏器
上海亚荣生化仪器厂。
1.3方法
1.3.1杏仁蛋白的提取
参照文献[11]的方法进行。
1.3.2杏仁蛋白的酶解工艺
取一定量杏仁蛋白粉(粗蛋白含量85%，以干基
计)，按4%(W/V)底物浓度加入双蒸水，在夹层玻璃反
应器中搅拌，待温度恒定后，调节一定的pH值，按
酶活与底物比为0.12AU/g加入蛋白酶开始水解，搅拌状
态下不断加入0.5mol/L NaOH，以使反应体系的pH值始
终维持在实验要求范围内，用pH-stat法测定水解度，
水解一定时间后，终止反应，沸水浴灭酶15min。冷
却后以12000r/min离心30min，取上清液冷冻干燥，4℃
贮藏备用。
1.3.3水解度的测定
采用pH-stat法[12]，水解度(DH)的计算公式为：
BNb
DH(%)＝—————×100
　　　 αMPhtot
式中：B为碱液体积(ml)；Nb为碱液浓度(mol/L)；
α为α-氨基的解离度；MP为底物中蛋白质含量(g)；htot
为底物蛋白质中的肽键总数(mmol/g)，对杏仁蛋白而
言，htot＝7.58mmol/g。
1.3.4水解物ACE抑制活性的RP-HPLC测定
参照Wu等[13]的方法，并加以改进。样品按一定
浓度溶于双蒸水，离心(12000r/min，15 )后取上清液
进行ACE抑制活性测定。取10μl样品溶液和10μl ACE
(0.25U溶于2.5ml pH8.3 0.1mol/L硼砂-硼酸缓冲液，其中
含0.3mol/L NaCl)于37℃保温6min，加入50μl 6.5mmol/L
底物(Hip-His-Leu溶于相同的缓冲液中)，37℃下反应
30min后，加入80μl 1mol/L盐酸溶液终止反应，至室
温取20μl反应物进样，通过RP-HPLC洗脱图谱计算马
尿酸生成量，以马尿酸的生成量判断样品对ACE的抑制
作用，同时用硼砂-硼酸缓冲液代替样品溶液做空白对
照 。
　　　 马尿酸峰值对照品－马尿酸峰值样品
样品对ACE的抑制率(%)=——————————————×100
　　　　　　 马尿酸峰值对照品
高效液相色谱(RP-HPLC)系统：DIONEX P680型泵
(带在线脱气机、梯度混合器、20μl定量环)和UVD 170U
型紫外检测器；色谱柱：DiamonsilTM 型C18色谱分析柱
(4.6mm×250mm)；洗脱液：25%乙腈-75%水(含0.1%
三氟乙酸)；流速：1.0ml/min；检测波长：228nm；进
样量：20μl；柱温：30℃。
1.3.5水解物的体外模拟消化[10]
取5mg胃蛋白酶和胰酶分别溶于pH2.0盐酸溶液和
0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)中，定容至100ml配制成
0.05mg/ml胃蛋白酶溶液和胰酶溶液。取50mg杏仁蛋白
水解物冻干粉溶于5ml 0.05mg/ml胃蛋白酶溶液中([E]/[S]
＝1:200)，37℃水浴振荡反应3h，调节反应体系的pH
值至中性，沸水浴灭酶5min终止反应。取2ml经胃蛋
白酶消化处理过的溶液，加入2ml 0.05mg/ml胰蛋白酶溶
液([E]/[S]＝1:200)，37℃水浴振荡反应4h，随后反应液
在沸水浴灭酶5min终止反应。12000r/min离心15min后
取上清液冷冻干燥，进行ACE抑制活性的测定。
2 结果与分析
2.1不同蛋白酶水解物对ACE抑制作用的研究
图1 马尿酸生成量的RP-HPLC色谱
Fig.1 RP-HPLC chromatogram indicating hippuric acid content
1800
0 2 4 6 8 10 12
添加杏仁蛋白水解物
m
A
U
时间(min)
1500
1000
500
－200
15
5.758
5.763
由图1可见，杏仁蛋白水解物与ACE反应生成的
马尿酸较空白对照组明显减少，说明杏仁蛋白水解物对
ACE有较强的抑制作用。
酶 酶解条件 ACE的抑制率(%)
Protamex 50℃，pH7.0 76.09
Proleather FG-F60℃，pH10.0 67.50
Alcalase 55℃，pH8.0 74.62
Neutrase 50℃，pH7.0 69.08
Flavourzyme 50℃，pH7.0 4.54
木瓜蛋白酶 55℃，pH7.0 74.74
表 1 6种蛋白酶的杏仁蛋白水解物(2.5mg/ml)对ACE的抑制作用
Table 1 ACE-inhibitory activities of hydrolysates (2.5 mg/ml) of
almond protein hydrolyzed by six proteases
空白对照
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图4 不同浓度杏仁蛋白水解物对ACE的抑制作用
Fig.4 ACE-inhibitory activities of hydrolysate by Proleather FG-F
or Alcalase at different concentrations
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
A
C
E抑
制
率
(
%
)
水解物浓度(mg/ml)
80
70
60
50
40
30
20
10
Proleather FG-F水解物
Alcalase水解物
食物来源的ACE抑制剂一般采用酶法生产，即将
食物蛋白用各种蛋白酶进行酶解，通过分离纯化提取酶
解产物中具有ACE抑制活性的多肽，因此酶的选择是
ACE抑制剂生产的关键[14]。不同酶的酶切位点不同，所
产生水解物的功能特性也会有较大差异。本实验中，不
同酶水解所得的杏仁蛋白水解物对ACE产生了不同的抑
制效果。从表1可知，各种蛋白酶的杏仁蛋白水解物对
ACE均有一定的抑制作用，但是差别较大。其中抑制
作用最强的是复合蛋白酶Protamex水解物，抑制率高达
76.09%，其次为木瓜蛋白酶及Alcalase、Proleather FG-
F两种碱性蛋白酶的水解物。风味蛋白酶Flavourzyme水
解物对ACE几乎无抑制作用，其抑制率仅为4.54%。
2.2不同蛋白酶酶解过程的水解进程曲线
图2 6种蛋白酶酶解杏仁蛋白的水解进程曲线
Fig.2 Hydrolysis course curve of almond protein hydrolyzed by six
pro teases
0 60 120 180 240 300
水
解
度
(
%
)
水解时间(min)
20
15
10
5
0
Protamex
Proleather FG-F
Alcalase
Neutrase
Flavourzyme
木瓜蛋白酶
在蛋白酶解过程中，酶解产物中多肽物质的结构
和组成成分随水解度而变化，因此水解度是影响酶解产物
ACE抑制活性高低的重要因素[14]。较高的水解度能保证较
好的蛋白溶出率，水解物中有较多具有活性的肽段。由
图2可知，Proleather FG-F和Alcalase两种碱性蛋白酶对
杏仁蛋白的水解度较大，90min后即超过16.90%，水解
120min后均达17.80%以上。随着水解时间进一步延长，
水解度基本保持不变。其他四种酶对杏仁蛋白的水解度
一直保持在较低水平，木瓜蛋白酶最低，始终维持在
3%左右。
综合以上6种酶酶解杏仁蛋白的水解物对ACE抑制
作用及水解度大小考虑，选择Proleather FG-F和Alcalase
两种碱性蛋白酶作进一步深入研究。
2.3两种蛋白酶水解物对ACE的抑制作用研究
2.3.1最佳酶解时间的确定
据报道，食物蛋白源ACE抑制肽的肽链长度一般
在2～15之间[10]。随着酶解时间延长，酶解得到的肽段
和游离氨基酸构成比例有所不同，水解物对ACE的抑制
作用也有所变化。由图3可以看出，在水解最初的90min
内，杏仁蛋白Proleather FG-F水解物的ACE抑制活性迅
速上升，最高达到68.61%，表明在此阶段ACE抑制肽
大量产生。之后呈现下降趋势，可能是由于一些对ACE
有抑制作用的肽被部分水解，降解成活性较小或失活片
段的肽或游离氨基酸；Alcalase是一种内切酶，在蛋白
水解中应用广泛。从图3可知，Alcalase水解杏仁蛋白
30min时的产物对ACE的抑制作用达58.55%，表明此时
水解即得到具有较高ACE抑制活性的肽段。随着水解时
间的延长，水解物对ACE抑制作用略有下降，这可能
是因为水解得到的部分肽段被进一步水解成游离氨基
酸，导致ACE抑制活性降低。90min后，Alcalase逐
渐水解出底物中更多具有较高活性的肽段，其对ACE的
抑制率不断增大，到180min时最高，达到75.70%，之
后稍有所下降。
根据以上结果，确定Proleather FG-F和Alcalase酶
解杏仁蛋白的最佳水解时间分别为90min和180min。
图3 不同酶解时间杏仁蛋白水解物对ACE的抑制作用
Fig.3 ACE-inhibitory activities of hydrolysate by Proleather FG-F
or Alcalase at different hydrolysis time
0 60 120 180 240 300
A
C
E抑
制
率
(
%
)
水解时间(min)
80
70
60
50
40
Proleather FG-F水解物
Alcalase水解物
2.3.2水解物对ACE的半抑制浓度
从图4可以看出，随着两种酶的水解物浓度增
大，其对ACE抑制作用也不断增强，当浓度为1.0mg/
ml时，两种酶的水解物对ACE抑制率较为接近。当
浓度为2.5mg/ml时，水解物对ACE抑制率分别达67.58%
和76.81%。相同浓度下，Alcalase酶解产物的ACE抑制
活性高于Proleather FG-F酶解产物。两种酶对杏仁蛋白的
水解度相差不大，但其水解物的ACE抑制活性却有差别，
这可能是酶对底物的特异性及作用位点的差异所造成的。
2009, Vol. 30, No. 05 食品科学 ※营养卫生252
对图4中数据分别取对数可得相应方程，由方程计
算出Proleather FG-F和Alcalase的杏仁蛋白水解产物对
ACE的半抑制浓度(IC50，即ACE抑制率为50%时的底
物浓度)分别为1.24mg/ml和0.98mg/ml，它们较接近于大
豆肽的IC50(1.20mg/ml)[15]。
2.4水解物的体外模拟消化
为考察杏仁蛋白水解物对胃肠道消化酶的抵抗作用
及对ACE有抑制作用的新的物质出现的可能性，在模拟
胃肠道消化生理作用的条件下对杏仁蛋白的Proleather FG-
F和Alcalase的水解物用消化酶(胃蛋白酶、胰酶)作进一
步消化处理，测定消化酶作用前后水解物对ACE抑制作
用的变化，评价水解物的消化稳定性，结果见表2。
酶 消化前对ACE的抑制率(%)消化后对ACE的抑制率(%)
Proleather FG-F67.58 49.36
Alcalase 76.81 50.35
表 2 水解物在消化酶作用前后对ACE抑制作用比较
Table 2 ACE-inhibitory activities of almond protein hydrolysate
(2.5 mg/ml) by Proleather FG-F or Alcalase before and after pepsin
and trypsin treatment
由表2可知，杏仁蛋白的Proleather FG-F和Alcalase
水解物经胃蛋白酶和胰酶连续消化后，对ACE抑制率分
别降低了18.22%和26.46%，均在50%左右，仍保持较
高抑制活性。由此可见，若应用到药物中，口服这两
种酶的杏仁蛋白水解物将有可能发挥降血压作用，但其
作用机理有待进一步深入研究。
3 结 论
3.1采用Protamex、Alcalase、Neutrase、Flavourzyme、
Proleather FG-F、木瓜蛋白酶水解杏仁蛋白，研究水解
物的ACE抑制活性。结果表明，除Flavourzyme外，
其他蛋白酶的水解产物对ACE均有较好的抑制作用，浓
度为2.5mg/ml时，抑制率均达67%以上。
3.2Proleather FG-F、Alcalase酶解杏仁蛋白的最佳水
解时间分别为90min和180min，对应的水解度分别为
16.91%和18.14%；两种酶的水解物对ACE的IC50分别
为1.24mg/ml和0.98mg/ml。
3.3Proleather FG-F、Alcalase酶解杏仁蛋白的水解物
经胃蛋白酶和胰酶消化后，ACE抑制活性仍较高，显
示出较好的体外消化稳定性。
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